[发明专利]一种基于多基因检测的肝癌筛查方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种可用于肝癌筛查的多基因检测方法，为肝癌的早期筛查提供了一种新的方法。

背景技术

肝癌（liver cancer）即肝脏恶性肿瘤，是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤。肝癌起病常隐匿，多在肝病随访中或体检普查中应用AFP及B型超检查偶然发现肝癌，此时病人既无症状，体格检查亦缺乏肿瘤本身的体征，此期称之为亚临床期。肝癌从第一个癌细胞形成发展到有自觉症状，大约需要2年时间，在此期间，病人可无任何症状或体征，少数病人会出现一些早期症状。包括：食欲减退，上腹闷胀、乏力等，有些病人可能轻度肝肿大。肝癌一旦出现症状而来就诊者其病程大多已进入中晚期，肝癌的典型症状和体征一般出现于中晚期。中晚期症状主要有肝痛、乏力、消瘦、黄疸、腹水等。临床上一般采取西医的手术、放化疗与中药结合疗法，但晚期患者因癌细胞扩散而治愈率较低，因此做到肝癌的早期筛查、早期发现、早期治疗具有非常重要的意义。

实时定量聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的CT值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

本发明利用实时定量聚合酶链式反应技术，建立了一种基于多基因检测的肝癌筛查方法，为肝癌的早期筛查提供了一种新的方法。

发明内容

本发明利用实时定量聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）技术，通过检测P53和beta-catenin基因的突变情况，筛选被测人员患肝癌的可能性。我们研究发现约有60%的肝癌患者中P53基因的249号密码子发生突变，从AGG突变到AGT，即由精氨酸突变到丝氨酸。通过对P53-249Ser的检测可以进行肝癌的筛选。我们设计的针对P53-249Ser检测的特异性的引物如下：

P53mu-deF:5’ AGGAGAATGGCGTGAACCTG3’

P53mu-deR:5’ GCCACAGGTTAAGAGGTCCC3’

TM=60℃, PCR产物长度：488 bp，扩增模板类型：DNA

同时，我们研究发现beta-catenin基因，在肝癌患者中也常发生突变，该基因在33、37、41和45号密码子分别由丝氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丝氨酸均突变成缬氨酸。我们也针对性的设计了特异性的引物如下：

beta-cateninmu-deF:5’GATGGAGTTGGACATGGCCA3’

beta-cateninmu-deR:5’CAGGGAACATAGCAGCTCGT3’

TM=60℃, PCR产物长度：4881bp，扩增模板类型：DNA

本发明通过检测被测者血清中P53和beta-catenin基因的部分密码子的突变情况，进行肝癌的筛查。

具体实施步骤如下：

步骤一：对待测者进行抽血，获得200ul以上的血清样本。

步骤二：对血清样本进行P53基因第249号密码子，beta-catenin基因第33、37、41和45号密码子的RT-PCR检测。

步骤三：对每个密码子的突变情况进行检测和分析。

步骤四：P53基因的第249号密码子突变为丝氨酸的，被测者患肝癌的风险较高，需要进行进一步检查确认是否患肝癌。

步骤五：beta-catenin基因第33、37、41和45号密码子，其中三个以上突变为缬氨酸的，被测者患肝癌的风险较高，需要进行进一步检查确认是否患肝癌。

以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其它实施方式，均在本发明的保护范围之中。