[发明专利]苹果茎沟病毒侵染性克隆载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及苹果茎沟病毒侵染性克隆的构建方法。

背景技术

苹果是全世界种植最广泛的重要水果之一。中国无论在苹果种植面积还是产量方面都是世界第一，约占全世界的四分之一。陕西省是中国的苹果种植大省，种植面积约600 000公顷，产量约占世界的12％(张雪阳等2005；张党利等2010；徐立等2010)。然而，苹果病毒病的发生却严重影响着苹果的产量和质量(李文慧等2006)。在中国，侵染苹果的主要病毒有苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)和苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)等(李文慧等2006)。其中苹果茎沟病毒分布于各大苹果种植产区，在全世界范围内发生(洪建等2001；Van et al.2000)。早在1989年刘福昌等(1989)研究发现，我国主栽苹果品种上，苹果茎沟病毒的带毒率为33％-100％。1994年王国平等(1994)报道，我国北方15个主栽梨树品种中，苹果茎沟病毒的带毒率为32.8％。苹果主要通过嫁接来繁殖，在嫁接的过程中容易造成病毒的传播。苹果树一旦感染病毒后会终生带毒，持久危害，主要表现为抗性降低生长削弱、器官畸形等，有的导致树体急剧衰退等症状，造成树体生长不良，果实品质和产量下降等严重的经济损失(Nemeth 1986)。病毒病以其面积大、危害损失严重成为苹果生产上的严重病害。苹果病毒病害的危害严重及防治困难，一直是苹果生产和理论上的一个重要问题。国外自二十世纪40年代以来就开展苹果病毒的研究，提出了有效的病毒脱除、检测技术和鉴定程序(Edwards et al.1985；Fuch 1980，1982；Lister et al.1965)。我国对果树病毒的研究起步较晚，但是我国的果树病毒病危害却较普遍。

由于苹果是重要栽培果树之一，陕西省又是中国的苹果第一大省。目前，包括苹果茎沟病毒在内的一些重要的苹果病毒严重影响着苹果的产量和品质，给苹果的安全生产带来了较大的危害(张雪阳等2005；张党利等2010；徐立等2010；李文慧等2006)。但是，目前对于这些重要苹果病毒的研究还较少，病毒的一些特性还不清楚，病毒的有效预防及控制还比较困难。本研究，针对苹果茎沟病毒开展其基因组测序与侵染性克隆等工作，是国内首次测定其全基因组序列，也是首次构建其侵染性克隆载体。通过测定苹果茎沟病毒的全基因组序列，并与世界上其它国家已报道的全基因组序列进行比较，以期了解其中国分离物的基因组特点。为研究该病毒的进化以及进一步了解该病毒，奠定重要的基础。构建该病毒的侵染性克隆载体，为进一步研究该病毒的基因功能奠定基础。

发明内容

本发明提供了一种苹果茎沟病毒侵染性克隆载体的构建方法，通过基因重组的方式，将苹果茎沟病毒CHN分离物的基因组克隆到Pcass-RZ载体双35S启动子的下游，获得了具有侵染活性的侵染性克隆Pcass-ASGV。利用Pcass-ASGV转化农杆菌，浸润接种昆诺藜，可以在昆诺藜植株内检测到苹果茎沟病毒外壳蛋白基因的表达。

本发明的技术方案是：

(1)从感染苹果茎沟病毒的苹果植株中提取病毒RNA；

(2)以植物总RNA为模板，分别设计特异性扩增苹果茎沟病毒的引物，引物序列如下：

涵盖苹果茎沟病毒的基因组全长；

(3)利用Overlap-PCR的方法分别将ASGV的8个片段拼接为2个大片段；

(4)利用限制性酶切的方法将2个大片段连接到植物表达载体Pcass-RZ的双35S启动子下游，获得带有ASGV全长基因组的重组表达载体Pcass-ASGV；

(5)将Pcass-ASGV转化农杆菌，并浸润接种寄主植物，观察寄主症状并ELISA检测。

本发明的优点：

(1)该侵染性克隆载体可以稳定保存；

(2)该侵染性克隆载体具有双35S启动子，无需体外转录，可用农杆菌浸润接种；

(3)苹果茎沟病毒不侵染人和动物，对环境安全；

附图说明