[发明专利]一种小鼠胚胎腭突体外旋转培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小鼠胚胎腭突体外旋转培养方法，属于动物胚胎培养技术领域。

背景技术

先天性唇腭裂是人类最常见的出生缺陷之一，其发病机制复杂，涉及遗传、环境等多种因素的相互作用。虽然唇腭裂的确切病因和发病机制尚未完全阐明，但是体内和体外的实验研究在揭示唇腭裂的发病机制方面已经取得了很大的进展。运用唇腭裂动物模型进行体内实验，至今仍是最常用的实验方法。但是体内实验受机体本身多种因素的干扰。为排除体内因素的影响，器官培养就成为最主要的方法之一。所谓器官培养是指从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而保持其原有器官的结构，直接将器官或器官的一部分在体外生长和移植。其目的是在体外情况下，维持器官内部的发育分化以及结构与功能特征，这样可以直观地观察和研究器官的发育分化过程。

20世纪中期，表面培养方法、悬浮培养方法以及金属栅栏式培养方法相继问世，随着分子生物学技术的进步，涉及唇腭裂发病的确切病因和机制正在趋向完善。体外的腭突器官研究在揭示唇腭裂发病机制上已经取得了很大进步，体外动物模型的建立模仿体内胚胎发育，至今仍然是最常用的实验方法。传统的腭突组织体外培养方法主要是为腭突组织提供一种静态的、二维的体外生长环境，但是此装置可以为腭突组织提供动态、三维生长，较好的模拟体内胚胎发育。使用此组织培养仪，进行小鼠腭突组织体外培养，可观察到腭突成功融合的现象。另外，在小鼠胚胎腭突组织培养过程中，腭突培养24h-48h期间，要进行培养液的更换，以保证体外腭突器官有足够的营养支持，除此之外，腭突器官培养也需要一定的物理性机械刺激，促进其生长发育融合，而这些物理性机械力的刺激是传统腭突组织体外培养方法无法达到的。

中国专利CN201210416329.7和CN201310617790.3公开了类似的培养器和培养方法，但是，他们是针对整个胚胎的培养。本发明在结合现有技术的基础上，进一步改良了腭突组织的培养方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种小鼠胚胎腭突体外旋转培养方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种近交系小鼠胚胎腭突体外旋转培养方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）将孕13.5天的近交系小鼠脱颈处死，在75%的酒精中浸泡消毒；无菌环境下，取出胚胎，在解剖显微镜下解剖取材，将胚胎上的融合前的腭突组织取出。

（2）将腭突组织放置于直径为3cm的培养皿内的微孔滤膜上并加入培养液，并保证滤膜漂浮在培养液表面；将置有腭突组织的培养皿放入旋转培养仪，设定旋转培养仪的转速为30-40转/分钟；将旋转培养仪放到含有5%的二氧化碳、37℃的培养箱中培养。

（3）第一次换液：步骤（2）培养24h后，无菌条件下取出旋转培养仪并更换培养皿中的培养液，加入相同体积和成分的培养液，然后在培养液中额外加入海藻多糖和叶酸，海藻多糖、叶酸、培养液的重量比是3-4：1-2：10；同时将旋转培养仪的转速匀速升高到50-60转/分钟。

（4）第二次换液：步骤（3）培养12h后，无菌条件下取出旋转培养仪并更换培养皿中的培养液，加入相同的培养液，然后在培养液中额外加入牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇，牛血清白蛋白（BSA）、聚乙二醇、培养液的重量比是2-5：1-3：10；同时将旋转培养仪的转速降低为20-25转/分钟。

（5）步骤（3）培养6h后，将旋转培养仪的转速匀速降低到零，旋转培养仪静止后，继续培养，直到腭突组织的双侧腭突完全融合，培养结束。

优选的，在步骤（3）中，升高转速时每分钟升高0.5-1转，且转速每升高5转，保持转速30-40min，然后继续升高。

优选的，在步骤（4）中，降低转速时每分钟降低0.5-1转，且转速每降低5转，保持转速30-40min，然后继续降低。

优选的，在步骤（5）中，降低转速时每分钟降低0.5-1转。

优选的，本发明中海藻多糖选自藻酸、褐藻糖胶、硫酸多糖、琼胶、卡拉胶中的一种或多种。进一步的，本发明提供一种最佳的海藻多糖组合，是褐藻糖胶和琼胶的混合物，两者的重量比是10:1-3。

本发明使用的培养液的成分为：DMEM/F12（1:1）培养基和10%胎牛血清FBS（Hyclone公司，美国），1%青霉素-链霉素溶液（Hyclone公司，美国）。