[发明专利]一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法

说明书

本发明公开了一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，属于细胞生物学技术领域。本发明构建了含有Sema3A基因序列的重组质粒，通过将Sema3A重组质粒和辅助包装质粒转染进入293T细胞获得Sema3A慢病毒载体，慢病毒载体在polybrene的协助下将Sema3A基因导入脂肪干细胞，显著地促进了脂肪干细胞的成骨分化，同时也抑制了脂肪干细胞向成脂方向的分化，导入Sema3A基因可以更好地将脂肪干细胞应用于促进骨缺损愈合和种植体骨结合，充分发挥脂肪干细胞来源广泛，易于获取的优点。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力和向多种功能细胞方向分化的细胞。其具有良好的增殖和免疫调节能力和再生各种组织器官的潜能，能显著扩大参与组织修复的细胞数量，科研工作者陆续开发出了基于干细胞多向分化潜能的干细胞技术，包括骨髓移植治疗造血功能障碍，分离培养人体皮肤内的干细胞制作成人工皮肤，用于烧创伤治疗等等。

随着发育的进行，大面积骨缺损在人2岁以后就失去了自然愈合的能力，干细胞被应用到组织工程骨的各种支架材料上，作为促进骨质愈合的种子细胞。科研工作者将来源广，取材方便，伤害性小的脂肪干细胞用于促进骨缺损的愈合，结果证实其对骨缺损愈合起到了一定的促进作用。但脂肪干细胞成骨能力较弱，其更易向脂肪组织分化，这限制了脂肪干细胞在骨缺损愈合方面的应用。因此，脂肪干细胞的分化方向需要进行调整，成脂分化需要得到抑制，成骨能力需要进一步的增强。

目前得到证实调节脂肪干细胞分化的方法主要有四种：一是使用荧光标记流式细胞仪筛选的方式将成骨能力较强的脂肪干细胞从干细胞群体中挑选出来进行扩增然后使用，这种方法每一次使用脂肪干细胞都需要进行荧光标记和流式细胞仪筛选，费时费力，降低了脂肪干细胞取材和使用方便的优势；二是使用成骨诱导液对脂肪干细胞进行成骨诱导，然后再应用到组织工程骨上促进骨缺损的愈合，这种方法只是将脂肪干细胞的成骨能力提前在体外得到发挥，并没有从本质上促进脂肪干细胞的成骨分化，对脂肪干细胞的成脂分化也没有影响；三是使用BMP等能促进脂肪干细胞成骨分化的细胞因子直接添加到培养基中或者以各种缓释的方式在体内对脂肪干细胞发挥作用，这种方式可以从本质上提高脂肪干细胞的成骨分化能力，但是其作用时间有限，促成骨或者抑制成脂的作用难以保持稳定、持久；四是使用小分子化物，例如地塞米松、他汀类药物对脂肪干细胞进行干预提升其成骨能力，这种方法比较简便且花费较少，但是作用效果有限。

因此，能够有效、持久、简便地促进脂肪干细胞成骨分化同时抑制其成脂分化的方法需要探索。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，该方法能够持久、有效、简便地促进脂肪干细胞成骨分化同时抑制其成脂分化。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种采用Sema3A基因促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，包括以下步骤：

1)将Sema3A的基因序列克隆到质粒上，获取Sema3A重组质粒；

2)将Sema3A重组质粒转化进入细菌，并对Sema3A重组质粒基因进行测序验证；

3)将测序验证过的含有Sema3A重组质粒的细菌进行扩增培养，然后提取扩增培养后细菌内含有的Sema3A重组质粒；

4)将Sema3A重组质粒和辅助包装质粒共转入293T细胞，获取Sema3A慢病毒表达载体；

5)将获取的Sema3A慢病毒表达载体感染脂肪干细胞，促进脂肪干细胞成骨分化、抑制成脂分化。