[发明专利]一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及杀虫真菌细胞领域，具体说是一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法。

背景技术

莱氏野村菌作为虫生真菌成为生物防治领域理论研究和生产应用的热点，莱氏野村菌在固体培养基表面出现两型生长现象，即由酵母型细胞状态向菌丝生长状态转换，一方面，莱氏野村菌酵母型细胞类似虫体内的虫菌体，在液体发酵中产生的芽生孢子生长迅速，适用于大规模的工业生产；另一方面，在邵长文研究开发的ATMT系统中酵母型细胞作为受体细胞，因此无论是工业生产或实验室研究，都给莱氏野村菌酵母型细胞的培养提出了现实需求。

目前，莱氏野村菌酵母型细胞的获得方法有两种：一是用接种器在固体培养基表面划线制备，这种方法制备量小，对分生孢子的分散效果不佳，这是由于莱氏野村菌由酵母型细胞向菌丝型的转换受群体密度的影响，往往只能在划线的末端区域会出现酵母型细胞菌落，而且所得的酵母型细胞的纯度不高，在显微镜视野内有大量菌丝体，需要多次转接纯化才能得到高纯度的酵母型细胞；第二种是采用制备分生孢子悬浮液的方法，这种方法虽然孢子的分散效果较好，但是很容易污染，并且酵母型菌落长出时边界不明显，不便于确定刮取酵母型细胞的时间，因此探索获得高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法亟需研究。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，包括以下步骤：

①将麦芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉搅拌均匀，得到混合液，将混合液在120~125℃下灭菌20~30分钟，然后均匀倒在平板上至2~3毫米的厚度，冷却后得到培养基；所述麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和蒸馏水的重量体积比为2~5g：0.8~3g：0.8~3g：0.8~1.5g：90~95ml；

②用灭菌的接种器蘸取莱氏野村菌分生孢子，置于步骤①得到的培养基表面上方5~7厘米处，敲击接种器，将莱氏野村菌分生孢子均匀撒在步骤①得到的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为0.5~3个/cm²；

③将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种的培养基置于温度24~30℃，湿度为75~90%的光照环境中，96~120小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞；

④用灭菌的工具刮取步骤③所得的莱氏野村菌酵母型细胞至步骤①所得的培养基表面，用涂布器涂布均匀，置于温度24~30℃，湿度为75~90%的光照环境中，18~24小时后得到5~10倍接种量的高纯度莱氏野生菌酵母型细胞。

优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，步骤①为将麦芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉搅拌均匀，得到混合液，将混合液在121℃下灭菌25分钟，然后均匀倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷却后得到培养基；所述麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和蒸馏水的重量体积比为4g：1g：1g：1g：93ml。

优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，所述接种器为接种环、接种针或玻璃棒。

优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，涂布器为不锈钢筷子或顶端烧圆的玻璃棒。

优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，工具为平头镊子。

优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，步骤②中莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为2个/cm²。

优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种培养基置于温度26℃，湿度为80%的光照环境中，96小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞。

进一步优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，包括以下步骤：

①将麦芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉搅拌均匀，得到混合液，将混合液在121℃下灭菌25分钟，然后均匀倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷却后得到培养基；所述麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和蒸馏水的重量体积比为4g：1g：1g：1g：93ml；

②用灭菌的接种环蘸取莱氏野村菌分生孢子，置于步骤①得到的培养基表面上方6厘米处，敲击接种环，将莱氏野村菌分生孢子撒在步骤①得到的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为2个/cm²；