[发明专利]一种快速鉴定纯合子转基因羊的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及转基因动物遗传育种领域，具体地，涉及一种快速鉴定纯合子转基因羊的方法及其应用。

背景技术

转基因技术是现代农业中重要的遗传育种技术之一，在转基因动物的研究中，若外源基因随机插入动物基因组中，插入拷贝数和位点都不确定，在进行转基因后代育种时，后代会出现基因分离现象，从而导致转基因遗传不稳定或表达不稳定的现象。转基因动物自交群体由杂合子转基因动物、纯合子转基因动物、同胞非转基因动物组成，只有纯合子转基因的动物才能稳定遗传，而不会出现性状分离现象，也只有纯合子的转基因动物才能作为侯选的优良育种材料。因此，如何快速、准确地鉴定和筛选出纯合子转基因羊是转基因羊育种的关键之一。

传统的转基因动物纯合子鉴定方法常为Southern杂交法，Southern杂交法是分子生物学的经典实验方法，CGH、FISH等方法也常用于转基因拷贝数及纯合子的分析(Larramendy M L et al,1998；Kall ioniemi A et al,1996；Armour J A et al,2000)。但上述方法存在一定缺陷，工作量大、周期长、步骤繁多、费时费力。Southern方法在基因组酶切消化不彻底的情况下会对插入基因拷贝数产生误判，同时在该实验过程中涉及放射性同位素等具有潜在危险性的药品，对发生重排的外源基因检测的精度不够等(Weng H B et al,2004)。近年来，利用实时荧光定量PCR的方法来进行外源基因定量检测的方法迅速发展起来，而实时荧光定量PCR的检测结果和Southern杂交法的检测结果接近(Ingham D J et al，2001；Song P et al,2002)操作更简单易行。

实时荧光定量PCR在实际应用中该方法主要体现在两种方式上:一种是利用已知外源基因拷贝数的基因组作为标准品,通过建立标准曲线来进行绝对定量；另一种则是以基因组上已知拷贝数的内源基因作为内参,通过相对定量法来确定外源基因的拷贝数。在应用绝对定量法来检测转基因拷贝数时，基因组 DNA与标准品的绝对定量的误差等可能会导致实验结果的不稳定与较大的误差。而目前的相对定量法在构建质粒标准品时多为将内参基因与目的基因分别构建阳性质粒，这种方法造成阳性质粒中基因的拷贝数无法精确定量，导致标准曲线的误差，造成实验结果不准确并大大增加了工作量。

因此，本领域迫切需要开发一种能够克服上述已有技术缺陷，并且能够快速鉴定纯合子转基因羊的鉴定方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速鉴定纯合子转基因羊的鉴定方法。

本发明的另一目的是在于提供了一种纯合子转基因羊在转基因羊纯系建立和转基因羊新品种培育中的应用。

本发明的第一方面提供了一种用于鉴定纯合子转基因羊的特异性引物对，所述引物对包括扩增PrP基因的第一引物对，所述第一引物对包括上游引物和下游引物：

上游引物PrP-F2：5’-ACCCAGATTTTAACATAGAG-3’(SEQ ID NO.:1)；

下游引物PrP-R2：5’-TTTTACAGAAACCAAGGACC-3’(SEQ ID NO.:2)。

在另一优选例中，所述PrP基因为内参基因。

在另一优选例中，所述的第一引物对的上游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。

在另一优选例中，所述的第一引物对的下游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。

在另一优选例中，所述引物对还包括扩增hLZ(人溶菌酶)基因的第二引物对，所述第二引物对包括上游引物和下游引物：

上游引物hLZ-F2：5’-AGTTCCCTTCAGTCACTCTTTGT-3’(SEQ ID NO.:3)；

下游引物hLZ-R2：5’-TCATCCCTTCACTCATTCATTC-3’(SEQ ID NO.:4)。

在另一优选例中，所述的第二引物对的上游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。

在另一优选例中，所述的第二引物对下游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。

在另一优选例中，所述第一引物对和所述第二引物对带有可检测标记。

本发明第二方面提供了一种用于鉴定纯合子转基因羊的特异性引物对组 合，包括扩增PrP基因的第一引物对，所述第一引物对包括上游引物和下游引物：