[发明专利]核酸的检测方法

说明书

本申请是原申请的申请日为2012年2月9日，申请号为201280008546.0， 发明名称为“核酸的检测方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及使用DNA生物芯片的核酸的检测方法等。详细而言，涉及通 过利用了应用点凝胶的分子筛效果的凝胶保持型DNA生物芯片的在芯片上的 (on-chip)PCR反应进行的核酸的特异性检测方法等。

背景技术

DNA生物芯片是以固定化的DNA为探针与待检测核酸进行杂交反应的 工具。

近年来，使用这样的DNA生物芯片进行待检测核酸中的特定的碱基序列 的检测，在疾病相关基因的探索、临床诊断等领域中的实用化正在推进。

作为DNA生物芯片，已知例如利用光刻(Photolithography)在2维表面 上逐次合成探针的DNA生物芯片(参照专利文献1)、以预先合成的探针在2 维表面上进行点样的DNA生物芯片(参照专利文献2)、在树脂板等基板上形 成多个槽或贯通孔，在这些槽或孔的内部保持包含DNA的凝胶的DNA生物 芯片(参照专利文献3)、在平面基盘上配置包含DNA等的凝胶的点的DNA 生物芯片(参照专利文献4)等。本发明人中的一部分也开发了通过下述方法 得到的DNA生物芯片：制作在中空纤维的中空部保持有凝胶的中空纤维排列 体，在与该排列体的纤维轴交叉的方向上切断(专利文献5参照)。

在以往的DNA生物芯片的使用方法中，由于存在于待检测物中的目标核 酸通常为微量，因此需要预先通过T7扩增法、PCR法等对目标核酸进行扩增。 此外，对于杂交反应，有时会花费一个晚上。因此，认为有必要使从反应至检 测更简化。

为了缩短检测到目标核酸的时间，公开了多种在DNA生物芯片上进行 PCR反应的技术。例如，在非专利文献1中公开了下述技术：利用在用规定 的氨基硅烷试剂修饰后的玻璃基板的表面上共价结合有成为引物的DNA链的 DNA生物芯片，通过固相PCR(PolymeraseChainReaction)进行DNA扩增。

此外，在非专利文献2中，代替玻璃基板，使用聚(甲基丙烯酸甲酯)， 使用表面上固定化有DNA片段的DNA生物芯片来评价与规定的DNA链的杂 交特性和在PCR样环境下的热稳定性。

作为进一步具体的应用的例子，正在尝试开发非专利文献3～4所示那样 的迅速的微生物鉴定方法、单核苷酸多态性的检测方法。

然而，这些方法中仍然存在一些问题。特别是作为在基板上固定化有核酸 的DNA生物芯片上的PCR反应的代表性的问题，可以列举下述1)～3)几 点等。

1)热循环处理时(PCR反应时)，固定化的引物会发生偏移。

2)如果在基板表面上进行PCR反应，则核酸的延伸反应效率低。

3)在PCR反应时，会发生非特异性的检测。

针对这些问题，正在考虑一些解决方案，但需要对基板上进行特殊的化学 修饰，不能使用通常的核苷酸(使用取代核苷酸)等，实用性低(参照专利文 献6～9)。

还有，除此以外，还公开了不将核酸固定化在基板表面上而是利用凝胶垫 (gelpad)的DNA生物芯片技术。已知可以在DNA生物芯片上的凝胶垫内 通过扩增反应和个别碱基的延伸进行检测反应(参照非专利文献5)。

使用凝胶的DNA生物芯片(参照专利文献3～5)与在2维表面上固定有 探针的DNA生物芯片相比，一个区划所能固定化的探针量增加。因此，可以 说是杂交效率(与探针结合的核酸相对于用于杂交的核酸的比例)优异的DNA 生物芯片。

上述利用凝胶的DNA生物芯片能够通过作为检测对象的样品(以下，待 检测物)在凝胶的多孔质结构中充分扩散并与凝胶中的探针进行反应，获得高 杂交效率。然而，在迄今为止已知的凝胶DNA生物芯片中，有时不能使待检 测物在凝胶的多孔质结构中充分扩散，仅能用于检测凝胶表面。