[发明专利]一种病毒检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种柑橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。

背景技术

柑橘是世界第一大水果，其国际年贸易额仅次于小麦和玉米，为第三大国际贸易农产品，在各国的国民经济中占有举足轻重的位置。但是，柑橘在生长过程中易受各种病毒、类病毒及一些原核生物如寄生细菌的感染而致病，从而引起产量变低、品质变劣，严重的导致植株衰弱，甚至死亡。目前世界上已报道的柑橘病毒病和类似病毒病有80多种，给柑橘生产带来很大影响。

柑橘裂皮病是由柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)引起的一种世界范围的重要柑橘病害，在我国分布广泛，可以通过嫁接或修剪用的工具机械传播，主要危害以枳、枳橙和兰普来檬作砧木的柑橘，能够引起砧木部树皮纵裂或翘起，最后呈鳞片状剥落，导致树势衰弱、植株矮化和严重减产。CEVd是马铃薯纺缍形块茎类病毒属成员，其分子结构具有高度碱基配对的共扼环状RNA。目前，无毒化生产是防治柑橘裂皮病的主要措施，而无毒化生产要求一种准确、灵敏、简便、快速的检测方法。柑橘裂皮类病毒的传统指示植物检测法虽然稳定可靠,但检测周期长,且需要温、网室等配套设施；聚丙烯酰胺凝胶电泳和分子杂交等方法,能稳定地检测已经嫁接传播到指示植物上的CEVd,然而由于春季和冬季类病毒在田间寄主植株内含量低,直接采样检测时稳定性不高；虽然已有应用RT-PCR方法检测CEVd的分子生物学检测报道，但是仍然存在操作繁琐、取样大、灵敏度不高等问题。

环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见Notomi T等，Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12):E63)，而逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)基于LAMP建立，其在反应体系中增加了逆转录酶，使RNA的逆转录和cDNA的LAMP扩增在同一试管中一步完成。此外，RT-LAMP还具有检测速度快、操作简单和灵敏度高等优点：该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异性区域的引物和具有解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速和特异性地扩增靶序列。与RT-PCR相比，RT-LAMP的灵敏度显著较高，优势明显，可用于准确鉴定田间植株病害，及时监控发病情况，符合产业需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种柑橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。

为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供了一种柑橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒，其包括4条特异性引物，所述引物的核苷酸序列如下所示:

外引物F3：TGCCCAGCAATGGTCTA(SEQ ID NO:1)

外引物B3：GCGCATGCTCATAGTACGAA(SEQ ID NO:2)

内引物FIP：CGGCTAACCGTGGTCATGAACC-GGCTCTCGAAAAGCTCTGG(SEQ ID NO:3)

内引物BIP：TAGAAGTCGTGATGGCCGTCGA-CCCGATCAGCTAGACGTTAC(SEQ ID NO:4)。

进一步地，本发明的试剂盒还包括反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述反应缓冲液由2mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、0.6mM甜菜碱和6mM Mg²⁺组成。

在本发明的试剂盒中，优选外引物F3和外引物B3的浓度均为0.2μmol/μl，内引物FIP和内引物BIP的浓度均为1.2μmol/μl。

在本发明的试剂盒中，优选核酸染料为SYBR Green I。

进一步地，本发明的试剂盒还可以包括RNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。

在另一个方面中，本发明还提供了使用本发明的试剂盒对柑橘裂皮类病毒进行检测的方法。

本发明的柑橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒和检测方法针对CEVd的包膜蛋白编码基因的6个区域设计特异性和灵敏度高的4条引物，且一步完成逆转录和扩增步骤，假阳性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，无需使用热循环仪等仪器，成本低、操作简单、鉴定简便，适于CEVd的基础实验室和田间检测。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。