[发明专利]一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法

权利要求书

1.一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于利用来源于Thermotoga petrophila的β-葡萄糖苷酶和ThermotogathermarumDSM5069的阿拉伯呋喃糖苷酶，降解人 参皂苷Rb1、Rb2和Rc生产20(S)-Rg3。

2.根据权利要求1所述一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于所述β-葡 萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

3.根据权利要求1所述一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于所述阿拉 伯呋喃糖苷酶的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。

4.根据权利要求1所述一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于所述β-葡 萄糖苷酶是通过重组表达制备的，步骤为：

(1)以提取的Thermotogapetrophila基因组DNA为模板，用具有SEQIDNO:5所示的 核苷酸序列为上游引物和具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列为下游引物，PCR扩增得到β- 葡萄糖苷酶的DNA分子；

(2)将β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分别用NdeI和XhoI进行双酶切，连接 并转化得到含有β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重组质粒；

(3)将上述获得的重组质粒转化表达宿主E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导β-葡萄糖苷酶 表达，收集菌体，破碎细胞，70℃热处理30分钟，获得纯化的β-葡萄糖苷酶。

5.根据权利要求1所述一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于所述阿拉 伯呋喃糖苷酶是通过重组表达制备的，步骤为：

(1)以提取的ThermotogathermarumDSM5069的基因组DNA为模板，用具有SEQID NO:7所示的核苷酸序列为上游引物和具有SEQIDNO:8所示的核苷酸序列为下游引物，PCR 扩增得到阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA分子；

(2)将阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA分子和pET-28a分别用NcoI和XhoI进行双酶切，连 接并转化得到含有阿拉伯呋喃糖苷的DNA分子的重组质粒；

(3)将上述获得的重组质粒转化表达宿主E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导阿拉伯呋喃糖 苷表达，收集菌体，破碎细胞，70℃热处理30分钟，离心获阿拉伯呋喃糖苷。

6.根据权利要求1所述一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于降解条件 为：Rb1、Rb2、Rc各1g/L，β-葡萄糖苷酶0.15U，阿拉伯呋喃糖苷酶0.6U，pH5.0，85℃ 条件下，降解1h，最终可以将人参皂苷Rb1、Rb2、Rc转化为人参皂苷20(S)-Rg3，摩尔得 率为97.3％。