[发明专利]一种酶法制备稀有人参皂苷Rh1的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及稀有人参皂苷Rh1的制备方法，尤其涉及利用重组表达 的来源于α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Re生成Rh1。

背景技术

人参(Panaxginseng)是亚洲传统的名贵中药材，人参皂苷是其主要的生物活性物质， 具有生物活性显著、药理作用独特等特点。随着分析技术水平的提高，人参皂苷的化学成分 得到了进一步的明确，现已经分离鉴定出180余种人参皂苷单体，其中5种主要皂苷(人参皂 苷Rb1、Rb2、Rc、Re和Rg1)占总皂苷的80％以上，而人参皂苷(Rg3、Rh2、CompoundK、 Rg2、F1和Rh1)含量很低，称为稀有皂苷(AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2012， 94:673-682)，但其药理活性优于上述高含量的人参皂苷。

稀有皂苷Rh1具有启动和增强免疫应答，促进肝细胞增殖、杀伤肿瘤细胞，以及抗老化 等生理作用，可用于调节机体免疫功能，治疗和预防肝炎等。但稀有皂苷Rh1在植物中含量 很低，直接提取工艺复杂，成本太高。而人参皂苷Re在人参总皂苷中含量较高，与稀有人参 皂苷Rh1具有相似的化学结构，因此，可以通过对人参皂苷Re进行转化得到Rh1(图1)，但需 要特异性的降解C20位上的鼠李糖基和C6位上的葡萄糖基。

利用化学法和生物转化法可以将人参皂苷Re转化为Rh1。但化学转化法因其反应剧烈、 选择性差、副产物多等缺点而不被采用。生物转化具有反应条件温和，特异性好等特点而受 到青睐。目前人参皂苷的生物转化法主要有微生物转化法和酶转化法。微生物转化法因其转 化体系复杂，容易产生副产物，对产品的纯度有一定影响。如，董阿玲等发现黑曲霉和蓝色 犁头霉能转化人参皂苷Rg1生产人参皂苷Rh1，但存在转化周期较长，且有其它皂苷副产物 等缺点(中国药物，2001，10(3)：115-118)。酶法转化能避免微生物转化法的缺陷，但各 种酶对底物的专一性不同，降解的糖苷键类型也各不相同，因此，寻找能高效、特异性降解 人参皂苷Re生产人参皂苷Rh1的糖苷水解酶成为了研究关键。目前，还没有利用酶转化人 参皂苷Re生产人参皂苷Rh1的报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供了一种酶法制备稀有人参皂苷Rh1的方法，该方法所使用 的重组酶分别来源于Thermotogapetrophila的β-葡萄糖苷酶和黑曲霉(Aspergillusniger)的α- 鼠李糖苷酶。

技术方案：一种酶法制备稀有人参皂苷Rh1的方法，利用来源于Thermotogapetrophila 的β-葡萄糖苷酶和黑曲霉(Aspergillusniger)的α-鼠李糖苷酶，降解人参皂苷Re生产Rh1。

所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

所述α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。

所述β-葡萄糖苷酶是通过重组表达制备的，步骤为：

(1)以提取的Thermotogapetrophila基因组DNA为模板，用具有SEQIDNO:5所示的 核苷酸序列为上游引物和具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列为下游引物，PCR扩增得到β- 葡萄糖苷酶的DNA分子；

(2)将上述β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分别用NdeI和XhoI进行双酶切， 连接并转化得到含有β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重组质粒；

(3)将上述获得的重组质粒转化表达宿主E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导β-葡萄糖苷酶 表达，收集菌体，破碎细胞，80℃热处理40分钟，获得纯化的β-葡萄糖苷酶。

所述α-鼠李糖苷酶是通过重组表达制备的，步骤为：

(1)以提取的黑曲霉(Aspergillusniger)NL-1cDNA为模板，用具有SEQIDNO:7所 示的核苷酸序列为上游引物和具有SEQIDNO:8所示的核苷酸序列为下游引物，PCR扩增得 到α-鼠李糖苷酶的DNA分子；

(2)将上述β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分别用NdeI和XhoI进行双酶切， 连接并转化得到含有α-鼠李糖苷酶的DNA分子的重组质粒；

(3)将上述获得的重组质粒转化表达宿主E.coliBL21(DE3)，诱导α-鼠李糖苷酶表达， 收集菌体，破碎细胞，离心获α-鼠李糖苷酶。