[发明专利]鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记及其标记方法与应用

权利要求书

1.鉴定番茄叶霉病抗性的方法，其特征在于：所述方法是通过利用分子标记的引物对番茄全基因组DNA进行PCR扩增和鉴定实现的；

所述分子标记的引物为：

Cf-5-Allele-F1：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTGAAATCATGTTTCCTGATCTT-3’；

Cf-5-Allele-F2：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGAAATCATGTTTCCTGATCTC-3’；

Cf-5-R：5’-CTTAGATTTCCAGTCGAGATCAAG-3’；

所述方法包括以下步骤：

a使用CTAB法提取番茄全基因组DNA；

b利用所述的引物Cf-5-Allele-F1、引物Cf-5-Allele-F2和引物Cf-5-R以番茄全基因组DNA为模板进行PCR扩增；所述PCR扩增的体系为KASP基因分型PCR反应体系，所述KASP基因分型PCR反应体系为：5ngDNA，0.07μl KASP 72×assay mix，2.5μl KASP V4.02×MasterMix，将上述三种物质混合，加ddH₂O至5μl；

其中，KASP72×assay mix由浓度为100μM的引物Cf-5-Allele-F1、引物Cf-5-Allele-F2和引物Cf-5-R与ddH₂O按12︰12︰30︰46的体积比混合得到；

KASP V4.02×Master Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，高保真酶和dNTP组成；其中，荧光探针A为：在5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’的5’末端连接1个FAM荧光基团；荧光探针B为：在5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’的5’末端连接1个HEX荧光基团；淬灭探针A为：在5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’的3’末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B为：在5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’的3’末端连接淬灭基团BHQ；

c对PCR扩增产物进行荧光扫描；

d分析等位基因分型结果。

2.如权利要求1所述的鉴定番茄叶霉病抗性的方法，其特征在于：所述步骤b中扩增反应程序为：阶段1：94℃预变性15min；阶段2：94℃20s，65-55℃1min，其中每个循环下降1.0℃，共10个循环；阶段3：94℃20s，55℃1min，共26个循环。

3.如权利要求1所述的鉴定番茄叶霉病抗性的方法，其特征在于：所述步骤c中荧光扫描是采用Kraken软件对扫描数据进行分析，根据分析结果确定番茄Cf-5的基因型，若待测番茄扩增产物荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测番茄Cf-5基因型为T︰T，即为番茄叶霉病抗病植株；若呈现红色，则基因型为C︰C，即为感病植株；若呈现绿色，则基因型为T︰C，即为杂合抗病植株。