[发明专利]一种梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，特别涉及一种梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法。

背景技术

天然右旋龙脑是从樟科植物中提取的一种珍贵药材和名贵香料，有抗癌治癌、抗菌消炎、消肿止痛、祛风醒神、开窍解毒等作用，广泛应用于医药、食品、化妆品和香料工业上，我国主要依赖进口，价格很高。目前我国用于提取右旋龙脑的最佳植物资源是龙脑樟，而广东省发现的梅片树是樟科植物阴香(Cinnammonia burmannii)的一个化学型，有研究人员通过水蒸气蒸馏法提取了梅片树叶中的挥发油，发现其主要成分有右旋龙脑(78.6％)、乙酸龙脑酯(3.26％)、斯巴醇(2.60％)和桉叶油素(1.92％)，说明梅片树叶富含右旋龙脑，是天然右旋龙脑的良好植物原料资源。但是梅片树的繁殖方式目前主要是有性繁殖和扦插，有性繁殖容易产生性状变异，扦插生根较慢，历时较长，且受制于环境和母株条数的限制。而采用组织培养技术不仅能解决该品种的繁殖困难问题，还可以通过细胞培养批量生产天然右旋龙脑，以改变其天然资源短缺状况和维护生态平衡，具有重要的经济价值和生态效益。

近年来，通过组织培养技术获得大量优质种苗、通过植物细胞培养进行天然有效成分的生产等生物技术已经取得了一些成就。然而，目前尚未发现梅片树组织快繁的相关报道，其细胞培养还处在愈伤组织的初步诱导阶段，还亟待完善愈伤组织的诱导培养，解决愈伤组织的继代保持培养、细胞系的筛选和悬浮细胞系建立等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法，它能够在短时间内产生大量优质的梅片树愈伤组织，解决愈伤组织继代过程中的褐化问题。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法，包括下述步骤：

(1)无菌外植体茎段或叶片的获取：选取右旋龙脑含量较高的梅片树优良植株，取其当年生枝条或嫩叶作为外植体进行消毒处理；将消毒后的嫩叶表面水分吸干，剪成1～2cm²左右大小的叶片；将消毒后的枝条剪成1～2cm长短的茎段；

(2)梅片树愈伤组织的诱导培养：取无菌梅片树的叶片或茎段，将其以平放的方式接种到愈伤组织诱导培养基上，置于培养箱中黑暗条件下培养25～35天，得到初代愈伤组织，培养温度为(25±1)℃；

(3)梅片树愈伤组织的继代培养：将初代愈伤组织中生长旺盛、质地疏松的淡白色愈伤组织转接到继代增殖培养基中，于(25±1)℃、黑暗条件下培养10～20天，获得大量继代愈伤组织；

(4)梅片树愈伤组织的防褐化培养：将生长状态较好的继代愈伤组织转接到不同的防褐化培养基中，于(25±1)℃、黑暗条件下进行培养，10～20天转接一次。

步骤(1)中，所述消毒处理是提前三天喷洒600～900倍多菌灵溶液，将采集的枝条和嫩叶用饱和的洗涤液浸泡10～30min，流水冲洗10～30min后晾干，于超净工作台内，将嫩叶用75％酒精浸泡10～50s，无菌水冲洗4～6次，再用0.1％HgCl₂溶液(加1～3滴吐温20)振荡浸泡4～10min，无菌水冲洗4～6次；将枝条用75％酒精浸泡30～120s，无菌水冲洗4～6次，再用0.1％HgCl₂溶液(加1～3滴吐温20)振荡浸泡8～15min，用无菌水冲洗4～6次。所述洗涤液可以用立白洗洁精溶液。

步骤(2)中，所述愈伤组织诱导培养基的组成为下述两者之一：(1)MS培养基、2～6mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.2～0.6mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10～30g/L的蔗糖和7～8g/L的琼脂粉；(2)MS培养基、0.1～1mg/L的萘乙酸、2～4mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10～30g/L的蔗糖和7～8g/L的琼脂粉。

步骤(3)中，所述继代增殖培养基的组成为下述两者之一：(1)MS培养基、2～6mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.2～0.6mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10～30g/L的蔗糖和7～8g/L的琼脂粉；(2)MS培养基、0.1～1mg/L的萘乙酸、2～5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10～30g/L的蔗糖和7～8g/L的琼脂粉。