[发明专利]一种体外扩增CD8+T细胞的方法

权利要求书

1.一种体外扩增CD8⁺T细胞的方法，其特征在于包括从癌性胸腹水来源提取得到TIL细胞，向TIL细胞培养液中添加包括细胞因子IL-2、CD3McAb和抗PD-1单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的一种体外扩增CD8⁺T细胞的方法，其特征在于所述的IL-2浓度为300-1000U/ml，CD3McAb浓度为10-50ng/ml，抗PD-1单克隆抗体50-200ng/ml。

3.根据权利要求1所述的一种体外扩增CD8⁺T细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)获取肿瘤细胞和TIL细胞混合体：

准备无菌肝素抗凝的抗凝瓶，从患者体内抽取胸腔积液或腹水，离心，弃上清液，生理盐水洗涤重悬。

(2)TIL细胞的分离：

细胞贴壁培养：

往步骤(1)获得的重悬细胞中缓慢加入100％淋巴分离液分离得到肿瘤细胞与TIL细胞混合体，生理盐水重悬细胞，离心收集细胞；收集得到的细胞用无血清培养液稀释至细胞浓度为5×10⁵-2×10⁶/ml，放置37℃、5％CO2培养箱培养，24小时后取出，将所得的TIL悬浮细胞移至另一培养瓶；或采用

非连续密度梯度培养：

对步骤(1)获得的重悬细胞采用非连续密度梯度离心法进行离心，从下往上依次加入100％淋巴细胞分离液、75％淋巴细胞分离液、去除上清液的胸腹水，经离心后，吸取100％淋巴细胞分离液界面TIL细胞，离心，弃上清，生理盐水洗涤重悬。

(3)TIL细胞扩增培养：

用无血清培养液稀释步骤(2)所得的TIL细胞密度为5×10⁵-2×10⁶/ml，向培养液中添加细胞因子抗PD-1单体，第2天加入细胞因子IL-2和CD3单抗，之后每隔2-3d加入含有细胞因子IL-2的无血清培养液，培养14-21天收集细胞。

4.根据权利要求3所述的一种体外扩增CD8⁺T细胞的方法，其特征在于所述步骤(2)细胞贴壁培养中稀释至细胞浓度为2×10⁶/ml。

5.根据权利要求3所述的一种体外扩增CD8⁺T细胞的方法，其特征在于所述步骤(3)中TIL细胞密度为2×10⁶/ml。

6.根据权利要求3所述的一种体外扩增CD8⁺T细胞的方法，其特征在于所述步骤(3)所述的无血清培养液为含有80U硫酸庆大霉素的X-VIVO15。

7.根据权利要求3所述的一种体外扩增CD8⁺T细胞的方法，其特征在于所述步骤(3)中抗PD-1单体的浓度为50-200ng/ml，IL-2的浓度为300-1000U/ml，CD3McAb的浓度为10-100ng/ml。

8.根据权利要求3所述的一种体外扩增CD8⁺T细胞的方法，其特征在于所述步骤(3)中抗PD-1单体的浓度为50ng/ml，IL-2的浓度为500U/ml，CD3McAb的浓度为30ng/ml。