[发明专利]一种表达脯氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母及其构建方法

权利要求书

1.一株重组表达脯氨酸氨肽酶的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌是以毕赤酵母GS115为表达宿主，以pPIC9K为表达载体，表达了核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的脯氨酸氨肽酶基因。

2.一种构建权利要求1所述毕赤酵母工程菌的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)设计引物扩增SEQIDNO.2所示的目的基因；扩增得到的氨肽酶基因编码的氨肽酶的N-端含有组氨酸标签；

(2)将PCR产物连接到表达载体pPIC9K上，获得重组质粒；

(3)测序正确的重组载体用PmeI进行单酶切，经酶切线性化之后，同毕赤酵母感受态细胞混匀，进行电击转化，筛选获取重组毕赤酵母。

3.一种应用权利要求1所述毕赤酵母工程菌发酵生产脯氨酸氨肽酶的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1挑取YPD平板上活化的菌落于25mLBMGY培养基中，30℃、230rpm培养20h；

(2)将培养液置于无菌离心管中离心收集沉淀，将沉淀重溶于25mLBMMY培养基中30℃培养168h，每隔24h向培养液中添加终浓度0.5％的甲醇进行甲醇诱导；

(3)将获得的发酵液，离心收集上清，即为氨肽酶胞外粗酶液，菌体沉淀稀释一定倍数后超声破碎，破碎液离心后即得胞内粗酶液。

4.一种脯氨酸氨肽酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

5.权利要求1所述毕赤酵母工程菌在脯氨酸氨肽酶生产中的应用。