[发明专利]一种快速高效的农杆菌介导的小麦茎尖遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域和植物基因工程领域，具体是一种快速高效农杆菌 介导的小麦遗传转化方法。

背景技术

小麦作为世界上重要的粮食作物之一，是人类获取蛋白质与热量的主要来源之 一。根据国际粮食政策研究所预测，世界小麦需求量将以每年1.6％的速度增长，但近十多 年来，由于耕地面积的不断减少和人口数量的持续增长，培育出优质，高产的小麦是一个急 需解决的问题。传统的小麦杂交育种过程缓慢，存在基因连锁和生殖隔离的缺点，很难产生 新品质的小麦。借助于一些理化条件的诱变育种，需要大量材料，并且难以控制诱变的方 向，有益突变率较低，难于进行筛选。以细胞融合的方式获得杂种细胞，培养并发育成植株 的细胞工程育种，技术复杂，难度较大，会导致生物品系减少，个体生存能力下降。目前，采 用基因工程的技术获得小麦新品种是最高效的育种方式之一。

1992年，世界上才成功获得第一例转基因小麦，作为最后一个转化成功的重要和 谷类粮食作物，其转化效率较低，重复性较差，转化规模较小，主要是因为两方面：一方面小 麦属于六倍体作物，且遗传背景复杂，其基因组较大(16000Mb)，是玉米基因组的7倍，水稻 基因组的35倍。且重复序列较多。另一方面小麦的遗传转化过程中DNA导入频率低，并且转 化后小麦愈伤组织的再生能力不强，有较强的基因型依赖性。所以导致小麦的遗传转化研 究起步较晚，进展缓慢。转化效率远远低于其他植物如玉米水稻等。目前为止小麦转化的方 法有：花粉管通道法，显微镜注射法等，基因枪法，电击穿孔法，PEG法等，目前小麦转化普通 采用的两种方法是基因枪法与农杆菌介导法。但是，基因枪法经济成本较高，容易造成外援 基因丢失，导致基因沉默。而农杆菌介导法具有操作简单，成本低，插入拷贝数较少，并能转 化一些相对较大的DNA片段等优点，近年来，通过农杆菌侵染小麦愈伤组织的方法已经广泛 的用于小麦遗传转化。但是该方法受到都须通过组织培养和植株再生途径，操作过程中要 求严格，消耗时间长，工作量大，容易出现玻璃化，褐化，细胞突变等问题。且小麦本身具有 较强的基因特异性，其基因组相对于其他作物较大，也增加了转化的难度。因此，能够创制 出不依赖组织培养技术的小麦植株水平的转化技术具有重大的意义。

ErwinSmith在一个世纪前对植物病原体进行研究时，发现了一种个革蓝氏阴性 的植物病原菌—根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)，研究发现：在植物受到损伤的 情况下，农杆菌能够侵染大多数双子叶植物和部分单子叶植物，植物受伤部位便会产生一 种特异的生物碱—冠瘿碱，进入农杆菌细胞内。从而导致携带有外源基因的Ti质粒上的T— DNA转移到受体细胞中，并整合到受体细胞的染色体上。农杆菌介导法的小麦遗传转化研究 所采用的受体材料有很多，包括：幼穗、幼胚、成熟胚、胚性愈伤组织、根尖、茎尖等。研究表 明：上述材料来源植物的不同生长发育阶段，具有时空差异性，针对不同的材料需采取了不 同转化以及培养方法，操作过程较为繁琐，为了提高转化效率，获得新的小麦品种。应该采 用较为理想的遗传转化材料，其应具有以下优点：第一，材料处理方式相对均一，具有高重 复性与普遍性。第二，材料分化程度低，细胞全能性强，具有发育成完整植株的可能性。第 三，材料容易获取，减少取材对实验的影响，便于进行实验。第四，材料相对较大，有利于遗 传转化成功。由于小麦成熟个体较大，材料均一，重复性高，且易获得，易保存，细胞全能性 强，是进行小麦遗传转化研究的理想材料。研究表明，传统小麦农杆菌遗传转化往往需要借 助植物组织培养技术，而其中小麦受体基因型是影响农杆菌转化效率的重要因素之一，不 同小麦受体基因型对农杆菌的敏感性不同，转化效率也显著不同，研究表明，只有部分小麦 基因型的受体材料再生频率高，绝大多数具有重要经济价值的小麦，其基因型差异较大，再 生性能差，仍然难以进行转化，因此，建立一个转化受体基因型依赖程度较低的小麦遗传转 化方法具有重大意义。

发明内容

针对上述领域中的需求，本发明提供了一种小麦遗传转化方法，避免了传统小麦 遗传转化方法中的缺点，包括植物组织培养中严格无菌条件，培养过程中生长周期长，所需 经济成本高，对材料的状态和基因型要求较高等，建立了一种简单方便高效快速的农杆菌 介导小麦茎尖的遗传转化方法。

一种快速高效的农杆菌介导小麦茎尖遗传转化方法，采用以下步骤：

1)取小麦成熟种子萌发，得到其发芽期个体，低温处理；