[发明专利]一种用于检测牛布鲁菌病的ELISPOT检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，特别是涉及一种用于检测牛布鲁菌病的ELISPOT检测试剂盒及其在牛布鲁菌病诊断领域的应用。

背景技术

牛布鲁菌病(以下简称“牛布病”)是由布鲁菌引起的人兽共患慢性传染病，家畜感染以后会出现不育以及流产等症状，公牛会出现关节炎以及睾丸炎，使配种能力明显下降，严重地威胁着牛群的健康状况，对畜牧业生产和人类健康造成非常大的危害。

布鲁菌是一种兼性胞内寄生菌，感染机体后可引起细胞免疫应答。细胞免疫应答可以产生一系列的细胞因子，这些细胞因子在机体对抗感染的过程中发挥重要的作用。在机体感染布鲁菌时，特定的免疫原性蛋白可以激活T细胞反应，包括活化巨噬细胞和CD4⁺、CD8⁺毒性T细胞，产生几种重要的细胞因子，如γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等。这些细胞因子在清除机体内布鲁菌的过程中起着重要的作用。特别是IFN-γ的分泌是宿主产生T细胞免疫反应的重要指标，其在对抗布鲁菌感染中发挥重要作用，通过检测抗原特异性的IFN-γ分泌状况可间接反映布鲁菌感染后产生的机体细胞免疫状况。IFN-γ主要是由特异性抗原刺激而活化的CD4⁺Th1细胞、CD8⁺T细胞及NK细胞等产生的细胞因子，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤活性以及免疫调节功能，是机体防御系统的重要组成部分。IFN-γ的免疫学检测是在特异性抗IFN-γ单克隆抗体(McAb)的基础上建立的用于对样本中的IFN-γ进行定性定量分析的实验方法。应用不同的单抗标记物和检测技术，已经开发出多种方法，如ELISA，酶联免疫斑点法(ELISPOT)，流式细胞术(FCM)分析法等。

现阶段布病的检测手段主要包括以下几种：(1)细菌学方法，通过培养病原体，根据其生物学特征进行判断，诊断的可靠性和准确性较高；(2)分子生物学技术，如建立的布鲁菌属特异性的PCR检测方法、针对布鲁菌的插入序列IS711建立了AMOS-PCR方法等；(3)血清学诊断方法，包括试管凝集试验(SAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等；(4)布鲁菌素皮内变态反应，其抗原为布鲁菌素(以下简称Br-PPD)。

但是，上述检测方法仍然不能满足本领域对牛布鲁菌感染的特异性检测的现实需要；且上述检测方法，不能满足本领域对牛布鲁菌感染早期检测的现实需要。

虽然目前ELISA是公认的特异性和敏感性相对较高的布病诊断方法，但其基于体液免疫检测，特异性不理想。由于耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O517等革兰氏阴性细菌中的脂多糖(LPS)与布鲁菌的LPS具有极高的同源性，抗原结构几乎完全一致，血清学检测时经常出现交叉反应，从而使针对特异性抗体检测方法的特异性受到一定程度影响，其中也包括ELISA检测试剂盒的特异性。

因此需要建立特异性更好的试剂盒用于牛布病的检测。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种针对牛布病的ELISPOT检测试剂盒，该试剂盒能够对牛布病进行高度特异性地检测。

本发明的ELISPOT检测试剂盒还能够实现牛布病的早期检测。

本发明涉及一种用于检测牛布鲁菌病ELISPOT检测试剂盒，所述ELISPOT检测试剂盒包括：支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照、特异性刺激剂，其中，所述捕获抗体为第一牛γ干扰素单克隆抗体，所述检测抗体为经过标记的第二牛γ干扰素单克隆抗体，特异性刺激剂为布鲁菌素Br-PPD，其中，所述支持介质与试剂接触面上有微孔滤膜；所述捕获抗体包被在支持介质上或所述捕获抗体与支持介质分别放置；以及所述捕获抗体与所述检测抗体能与牛γ干扰素共同发生抗原抗体结合作用。

本发明还涉及本发明的检测试剂盒在用于非诊断目的牛布鲁菌感染检测中的应用，其中，所述非诊断目的包括流行病学分析和研究、离体组织进行检测、表位鉴定研究以及定性和定量检验布鲁菌抗原特异的牛IFN-γ。

本发明的技术效果：

本发明试剂盒中所采用的由杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势。本发明基于Br-PPD的ELISPOT试剂盒，相比于其他的基于抗体的商品化ELISA试剂盒，能够实现牛布鲁菌感染的早期检测。并且，由于本发明基于Br-PPD的试剂盒为基于细胞水平的检测，相比于ELISA试剂盒，排除了交叉反应造成的假阳性的干扰，显示出良好的特异性。

附图说明