[发明专利]一种基于Cpf1的DNA构建物以及DNA体外拼接方法

权利要求书

1.一种用于DNA体外拼接的DNA构建物，其特征在于，所述DNA构建物中包括酶切割位点，并且所述DNA构建物含有结构如式I所示的核酸序列：

Ta-C-Tb I

式中，Ta为前缀序列；C为待拼接的核酸序列；Tb为后缀序列；

其中，所述前缀序列中含有第二酶切割位点，所述后缀序列中含有第三酶切割位点，所述第二酶切割位点不同于所述第三酶切割位点，并且所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点经酶切割后产生同尾序列；

其中，所述酶切割位点需要在crRNA的参与下被定位并切割；并且所述酶切割位点能够被CRISPR相关酶识别并切割，

并且，所述酶切割位点能够被Cpf1酶识别并切割，并且所述前缀序列和所述后缀序列经过酶切割后留下互补的用于DNA体外拼接的粘性末端；

并且，所述Tb还包括第四酶切割位点T4,所述第四酶切割位点位于所述第三酶切割位点的下游，并且所述第四酶切割位点与所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点不同；和

所述式I中，所述Ta还包括第一酶切割位点T1,所述第一酶切割位点位于所述第二酶切割位点的上游，且与所述第四酶切割位点、所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点不同。

2.如权利要求1所述的构建物，其中，所述Cpf1酶为FnCpf1酶。

3.如权利要求1所述的构建物，其中，所述待拼接的核酸序列长度≥500bp。

4.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的待拼接的核酸序列包括CDS序列、编码基因序列、抗生素生物合成基因簇、负责接合转移的元件或有特定功能的DNA序列。

5.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述待拼接的核酸序列长度≥1kb。

6.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述第二酶切割位点的核酸序列为：

5’-TTTACTCTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC-3’。

7.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述第三酶切割位点的核酸序列为：

5’-GGATCCACTAGTCTCTAGCTCGAGAAA-3’。

8.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述第四酶切割位点的核酸序列为：

5’-TTCAAGGAGAAACTGCAGCTAGCTTAAA-3’。

9.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述第一酶切割位点的核酸序列为：

5’-TTTGTTATCGCAACTTTCTACTGAATTC-3’。

10.如权利要求1所述的构建物，其中，Ta的核酸序列为：

5’-TTTGTTATCGCAACTTTCTACTGAATTCAAGCTTTACTCTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC-3’；

和/或

Tb的核酸序列为：

5’-GGATCCACTAGTCTCTAGCTCGAGAAATTCAAGGAGAAACTGCAGCTAGCTTAAA-3’。

11.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的构建物还含有位于式I所示的核酸序列上游或下游的选自下组的元件：

选择性标记基因、复制元件、启动子、终止子、poly(A)元件、转运元件、基因靶向元件、筛选标记基因、增强子和转座酶编码基因。

12.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的构建物。

13.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的基因组的一个或多个位点整合有权利要求1所述的构建物，或者所述宿主细胞中含有权利要求12所述的载体。