[发明专利]一种免疫增强型CAPRI细胞制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脐带血单个核细胞参与的免疫增强型 CAPRI细胞制备方法。

背景技术

CAPRI细胞又名链式CIK细胞，是单个核细胞在体外用多种细胞因子，如抗CD3单克 隆抗体、IL-2和IFN-γ等共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。CAPRI细胞具有安全有 效、杀瘤谱广、副作用小等传统生物治疗的特点外，还具有典型的个体化免疫治疗模式的特 点，其实施目的在于在手术、放化疗等传统治疗的基础上，控制病情（肿瘤停止发展、瘤体缩 小、甚至消失）、延长生存时间、防止复发和转移、消除微小残余瘤灶和转移灶、提高生活质 量（改善食欲、睡眠、恢复体重、免疫功能增强、生理机能提高）等。CAPRI细胞已经成为了新 一代肿瘤治疗中的主要效应细胞，广泛应用于临床实践。CAPRI细胞治疗原则上在化疗开始 前就应该规划，最好在手术后、化疗或放疗开始前采集患者外周血单个核细胞（PBMC），如条 件允许也可在化疗间隙期采集PBMC，由于采集PBMC后骨髓的再造旺盛，不宜马上进行化疗 或放疗以免骨髓损伤，在采集PBMC后至少间隔1周才能开始放化疗。收获CAPRI细胞时应尽 量避免化疗给药当天，最好能在给药后16-24小时收获细胞。在无法避开化疗给药的情况 下，可在化疗给药4小时后收获细胞。

鉴于CAPRI细胞在肿瘤免疫治疗上的显著疗效，从肿瘤患者外周血分离自体PBMC 进行链式激活和扩大培养的方法已十分成熟，较为经典的方法是德国申请WO02/087612A中 公开的级联引发刺激过程：起始的CD3激活阶段，将PBMC悬浮于培养基中，加入10%的 HyClone胎牛血清，并且沉积到固定化的抗CD3单克隆抗体上；IL2辅助阶段，在2-4小时CD3 激活之后，加入IL-2，辅助激活并防止凋亡；引发阶段，在2-3小时的IL-2辅助之后，将APC充 分活化用于引发初始PBMC；扩充阶段，将经引发的PBMC技术，重新悬浮在具有IL-2的补充培 养基中；72小时扩充后收获CAPRI细胞。然而，上述方法中获取PBMC时对患者身体状况具有 严格的要求，在①患者白细胞＜4000个/ml、②化疗后不到6周、③停止升白药物后不到2周、 ④患者体质差不能承受血细胞分离机采集单个核细胞过程、⑤其他不符合血细胞分离机采 集单个核细胞的情况下，PBMC的采集无法实现；在本申请人之前的专利申请 ZL201410232692.0中公布了一种半合子CAPRI细胞制备方法，其采用获取患者和半合子供 体外周血，分离、纯化外周血单个核细胞(PBMC)；从半合子供体血浆制备血清；PBMC激活； CAPRI细胞扩增；CAPRI细胞收获；CAPRI细胞冻存的制备方式，通过增加前期细胞处理步骤 以及双抗体装载方法，获得了细胞产量高且具有广谱杀瘤作用的CAPRI细胞。该半合子 CAPRI细胞制备方法有效解决现有技术中由于患者自身状况较差等因素导致的CAPRI细胞 培养无法进行的问题。然而，在上述制备步骤中，如果寻找不到合适的半合子单个核细胞供 体，培养CAPRI细胞足量的PBMC无法采集；再者此方法中制备获得的CAPRI细胞需要冻存，而 冷冻复苏操作必然存在对CAPRI细胞活性损伤、并相应地增加了仪器设备的投入。

已有研究表明，脐带血单个核细胞来源的CAPRI细胞与自体单个核细胞来源的 CAPRI细胞相比，具有更高的体外扩增能力和杀伤活性，而且脐带血细胞具有来源广泛、免 疫性低，潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播概率较低的特点。国内学者王小燕等(脐带 血CIK细胞表型变化与细胞毒活性相关性研究，肿瘤基础与临床)已经成功的从脐带血分离 单个核细胞，经细胞因子抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ诱导，体外培养扩增获得了CIK细 胞，其对U251细胞、SiHa细胞和A549细胞均具有较强的杀伤作用。但后续研究发现脐带血单 个核细胞来源的CAPRI细胞的杀瘤作用比较持续，而外周血单个核细胞来源的CAPRI细胞则 在初始具有较强的杀瘤作用，但后续作用减弱，因而，脐带血单个核细胞来源的CAPRI细胞 具有首剂效应不强的弱点。