[发明专利]一种用于制备中分子量右旋糖酐菌种的筛选方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种用于制备中分子量右旋糖酐菌种的筛选，属于右旋糖酐领域。

背景技术

右旋糖酐又名葡聚糖，是若干葡萄糖脱水形成的聚合物。它是世界上最早发现的并较早作为主要血浆代用品的微生物多糖。右旋糖酐是若干葡聚糖脱水形成的聚合物，主要由葡萄糖α-1,6糖苷键连接而成，由肠膜状明串菌株产生的右旋糖酐蔗糖酶。

目前国内多采用发酵方法制备高分子右旋糖酐，再利用盐酸水解得到不同分子量的药用右旋糖酐，由于生产的右旋糖酐含有大量的氯化物严重影响了右旋糖酐的质量和品质，在临床使用过程中常出现过敏反应，可引起皮肤反应、严重的呼吸和循环衰竭，甚至导致死亡。同时由于是酸催化水解，水解过程无序，得到的产品分子量分布不集中，影响产品的质量。另外，由于利用盐酸水解需要高温高酸等恶劣条件，不利于环保、低碳。

右旋糖酐分子量的调控方法包括有化学法、物理法和生物法。其中化学法是传统所使用的方法，主要是通过盐酸把大分子量的右旋糖酐降解成小分子量的右旋糖酐，该法由于反应条件剧烈，不易控制，反应后部分右旋糖酐被降解成了单糖，因而导致收率很低。物理的方法主要是利用超声波来截断大分子的右旋糖酐而获取低分子量的右旋糖酐；此法耗能较多，不适于大规模生产采用，且反应过程会产生很多热量，目前在这方面的研究还处于初步探索阶段。由于酶解法具有反应条件温和，耗能少，适于实现工业规模化生产等优点，因而目前有关采用酶来调控右旋糖酐分子量的研究也比较多。

发明内容

本发明主要解决的技术问题：针对传统化学法调控右旋糖酐分子量，主要是通过盐酸把大分子量的右旋糖酐降解成小分子量的右旋糖酐，该法由于反应条件剧烈，不易控制，生产的右旋糖酐含有大量的氯化物严重影响了右旋糖酐的质量和品质的问题，本发明利用葡萄皮上本身微生物进行培养，将培养后的微生物用a-氨基异丁酸在X射线仪照射下改性，改性后过滤得菌体悬浊液，将菌体悬浊液涂抹在生物素制得的培养基上培养，培养过程中加入6-苄基氨基嘌呤乙醇溶液，将培养得到的菌丝接种至筛选培养基中培养、筛分，最后收集菌种即可，本发明利用葡萄皮上自带的微生物进行改性、培养、筛选，工艺简单，成本低，筛选得到的菌种不仅活性高、稳定性好，而且利用其降解右旋糖酐，可得到分子量分布均匀的中分子量右旋糖酐，右旋糖酐的质量和品质好，降解过程条件温和，能耗少。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

（1）称取葡萄皮，使用蒸馏水将其冲洗干净，按重量份数计，取30～40份清洗后的葡萄皮、15～20份琼脂、8～12份牛肉膏及6～9份蛋白胨，搅拌均匀，使用质量分数为3％氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～7.2，再将混合物倒入发酵罐中，设定温度为30～35℃，空气通气量（V/V·min）为0.6～0.9；

（2）待发酵20～23h后去除发酵液，收集发酵物，按固液比1:2，将发酵物与质量分数为0.8％a-氨基异丁酸溶液混合均匀，使用X射线仪照射20～30min后，倒入混合机中在200r/min下搅拌20～30min，搅拌后进行减压过滤，收集过滤液，得悬浊液，备用；

（3）按重量份数计，取30～40份酵母浸膏、10～15份琼脂、8～12份蛋白胨、8～16份蔗糖及4～8份生物素搅拌均匀后，使用质量分数为5％氢氧化钠溶液调节pH至7.5～8.0，再将其放入高压灭菌锅中进行灭菌，得培养基；

（4）使用涂布棒将步骤（2）所得的悬浊液涂布在上述所得的培养基上，再将培养基移至摇床培养箱中，在25～28℃，150rpm下，培养6～9天，在培养过程中每隔10～12h，向培养基中加入生物素质量5～10％质量分数为2％的6-苄基氨基嘌呤乙醇溶液；

（5）按重量份数计，取30～35份葡聚糖T2000、15～20份质量分数为10％的硝酸钠溶液、1～2份磷酸二氢钾、1～2份磷酸氢二钾、0.1～0.4份七水硫酸亚铁及0.2～0.3份硫酸铜，搅拌均匀，使用高压灭菌锅对其进行灭菌消毒，得筛选培养基，使用接种棒将上述培养结束后培养基上的菌丝接种至筛选培养基中，再将其移至摇床培养箱中，在25～28℃，110rpm下，培养4～6天，收集筛选培养基上存活的菌种，即可得到用于制备中分子量右旋糖酐菌种。