[发明专利]全细胞催化合成L-2-哌啶甲酸的方法

说明书

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及全细胞催化合成L‑2‑哌啶甲酸的方法。本发明所公开的全细胞生物催化合成L‑2‑哌啶甲酸的方法是以L‑赖氨酸盐酸盐为底物，通过添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及含有Arenimonas donghaensis DSM 18148蛋白编码基因的重组宿主菌、或者含有Pseudomonas veronii CIP104663蛋白编码基因的重组宿主菌或者含有Streptomyces hirsutus ATCC 19091蛋白编码基因的重组宿主菌，通过生物催化制备L‑2‑哌啶甲酸。从而克服了目前化学合成法成本高、条件苛刻、转化率低、能耗高、污染大的问题。同时本发明所公开的生物催化系统酶活效率高，反应时间短，目标产物ee值高。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及全细胞催化合成L-2-哌啶甲酸的方法。

背景技术

L-2-哌啶甲酸是一种天然存在的非蛋白质构型氨基酸，是重要的手性药物中间体，可用于制备雷帕霉素，抗肿瘤剂VX-710，免疫抑制剂FK506，哌啶生物碱等，具有很高的产业化应用价值。目前的主要生产方法为化学合成，存在产率低，能耗高，污染大等缺点。同时ee值难以控制。

Fujii等利用重组表达L-赖氨酸-6-氨基转移酶和二氢吡咯-5-羧酸酯还原酶的大肠杆菌工程菌，在159小时积累到了3.9g/L产物。后续通过添加lysP赖氨酸透性酶和yeiE，在111小时最高积累到16g/L。该方案主要问题为反应时间过长，产物生成量过少，实际生产成本过高，难以放大生产。

Yasushi Tani等人通过共表达LysR，rAIP，DpkA，GDH等共四个蛋白，实现了从DL-lysine到L-2-哌啶甲酸的转化，46小时产物转化率达到87.4％，但涉及到多个蛋白的共表达，存在菌种构建难度大，重复性差等缺点。

Ying等利用含有pipA基因的大肠杆菌做为全细胞催化剂，并优化NAD浓度，反应温度，反应pH，金属离子以及表达活性剂添加等，最终产物可达到17.25g/L。该方案中pipA酶活不高，导致了使用全细胞量过多(OD＝200)，底物浓度不高(赖氨酸25g/L)，并且需要分批次添加底物才能反应完全。这些因素会导致在放大生产时成本过高等问题。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是开发一种高效率的生物催化系统，以期提高底物投量，缩短反应时间，并能获得高ee值的产物。

为了实现上述的发明目的，本发明的采用的技术方案如下：

全细胞生物催化合成L-2-哌啶甲酸的方法，以L-赖氨酸盐酸盐或L-赖氨酸为底物，通过添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及重组宿主菌，通过生物催化制备L-2-哌啶甲酸；其中重组宿主菌为含有Arenimonas donghaensis DSM 18148蛋白编码基因的重组宿主菌、含有Pseudomonas veronii CIP104663蛋白编码基因的重组宿主菌或者含有Streptomyceshirsutus ATCC 19091蛋白编码基因的重组宿主菌中的任意一种。其中，所述重组宿主菌为大肠杆菌。

进一步地，反应在pH8.0的磷酸钾缓冲溶液中进行。

优选地，反应温度为20℃-30℃。

同时，我们还优选公开反应在摇床上进行，摇床转速为180rpm。

最后，我们公开了其中重组宿主菌的浓度为50g/L-150g/L。

采用本发明所公开的全细胞催化合成L-2-哌啶甲酸的方法，克服了目前化学合成法成本高、条件苛刻、转化率低、能耗高、污染大的问题。同时本发明所公开的生物催化系统酶活效率高，反应时间短，目标产物ee值高。

附图说明

图1为NYPDc的表达质粒图谱