[发明专利]临床治疗级人胎盘底蜕膜来源的间充质干细胞(PDB-MSCs)无血清体外提取制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物干细胞技术，组织工程领域。涉及一种体外构建高模拟体内 贴附环境分离筛选，PDB-MSCs的培养、扩增技术。特别公开发明了一种临床治 疗级人胎盘底蜕膜层来源的间充质干细胞(PDB-MSCs)的高拟体内贴附环境细胞 外基质附着体外提取制备方法，发明特征包括体外分离及规模化培养扩增与保存 的方法。通过高拟体外细胞外基质附着锁定目标PDB-MSCs贴附培养，利用优选 的培养基组合，梯度无血清驯化培养体系获得临床治疗级别的PDB-MSCs一种科 学快速有效获取创新方法。本发明获得干细胞国际细胞协会(ISCT)标准具有高 纯度、干细胞增殖扩增、传代活性强、以及冻存保护细胞活性技术，该技术应用 是干细胞治疗领域核心基础，满足了PDB-MSCs干细胞临床药物设计开发与医疗 机构开展干细胞疗法回输安全有效应用的需求。

背景技术

近年来，国际国内对干细胞再生医学研究领域越来越重视，细胞治疗再生医 学得到了前所未有推进，科研领域沐浴在时代的朝阳下得以蓬勃发展。尤其是间 充质干细胞已经成为一种新的治疗手段广泛应用修复受损或病变的组织器官，治 疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、临床骨修复、软骨修复、骨髓再生、肌肉再 生、脂肪形成、肌腱修复、基因治疗、血管支持、角膜损伤、烧伤烫伤创面修复 等多种疾病。经过体外培养扩增后的干细胞在组织工程再生和多种组织修复中展 示出令科研工作者印象深刻的治疗广泛性潜能，这种潜能是科研领域毋庸置疑的 发展方向。

间充质干细胞(MesenchymalStemCellsMSCs)具有自我更新和多向分化的 能力。来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞。是一种非血源性的多功能 干细胞，广泛存在于人体不同组织中，如骨髓、脂肪、牙周膜及脐带，胎盘组织 等。近几年来有学者发现其主要来源骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymalstemcells,BMSc)可以自体移植，避免了移植后的免疫排斥,骨髓 间充质干细胞的体外扩增比较容易，而且具有跨系或跨胚层分化为不同组织来源 细胞的潜能，所以在临床已经应用于中枢神经系统、心血管及免疫系统等多系统 疾病的治疗，在癌症和遗传性疾病研究中也有涉及。BMSc可体外诱导分化为成 骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌母细胞、并在一定的条件下诱导可分化为神经 细胞，而且可进行自体移植，避免免疫排斥，被认为是治疗多种疾病的良好细胞 来源。也有研究者认为在胎盘组织中也含有丰富的间充质干细胞，提示可以将其 提取作为干细胞移植治疗的备选细胞。胎盘间充质干细胞具有采集方便、易于体 外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干细胞研究的一种理想种子细胞。

骨髓间充质干细胞，在美国FDA已批准在心肌干细胞移植方面进入一期临床 试验,这充分展示了MSCs的巨大应用前景。不过骨髓间充质干细胞在骨髓中的含 量较少，而且随着年龄的增加，在骨髓中的含量逐渐减少，其增殖分化能力也逐 渐减弱；同时骨髓间充质干细胞的取材是有创侵入性操作，增加了捐献者的痛苦 和感染的机会，所以骨髓间充质干细胞的临床应用受到了一定的限制,并且病患 严重感染、骨髓恶性肿瘤或随着年龄的增长,骨髓细胞数及增殖、分化能力均明 显下降等情况下,患者就无法顺利获得足量可用于治疗的BMSCs,为此很有必要 寻找新的MSCs来源。

再生组织工程细胞建立工作始于本世纪(Harrison1907,Carrel1912), 指导引领着生物学，临床医学材料等各大衔接领域，被称为重要的基础科学之一， 组织构建和细胞体外培养是至关重要的课题。从供体捐献者活体取组织，模拟体 内生理环境等系列特定体外微环境体系，进行孵化培养、使得组织细胞健康生长。 间充质干细胞对细胞外基质的黏附强快速特性，使得体外筛选培养人来源的间充 质干细胞得以在国内外方法特异性发展。而干细胞生物学性能，可以做到增进功 能，避免潜在有害基因对干细胞控制分化时间与控制不同分化方向等的影响，在 基础科研、临床治疗、干细胞治疗研究方向、再生损伤修复等均有历史时期的重 要不可取代的指导意义。