[发明专利]回输临床治疗用人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞体外三维分离培养保存方法

说明书

技术领域

本发明属于生物干细胞技术，组织工程领域。涉及一种体外构建高模拟体内贴附环境分离筛选，hCDMSC的无血清培养、扩增、储存技术。组织构建和细胞体外培养是再生医学干细胞治疗领域的至关重要的热门科技领域。回输临床治疗用细胞是一种前瞻性的医疗手段，本发明特征是采用人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞体外三维分离培养保存方法，获取高纯度的临床治疗用hCDMSC，采用细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)理论指导设计开发一种从未公开的报道的，叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质，筛选贴附培养技术。该培养体系保持原始未分化干性细胞，获取符合细胞协会(ISCT)标准的干细胞其活性与传代能力极强，无血清多组合培养液梯度驯化培养理论，使得hCDMSC具备回输治疗应用的安全性稳定性保障，是临床药物设计开发医疗机构开展干细胞治疗科技基础，同时也是组织工程领域具备前景的种子干细胞。

背景技术

近年来，国际国内对干细胞再生医学研究领域越来越重视，细胞治疗再生医学得到了前所未有推进，科研领域沐浴在时代的朝阳下得以蓬勃发展。尤其是间充质干细胞已经成为一种新的治疗手段，广泛应用修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、临床骨修复、软骨修复、骨髓再生、肌肉再生、脂肪形成、肌腱修复、基因治疗、血管支持、角膜损伤、烧伤烫伤创面修复等多种疾病。经过体外培养扩增后的干细胞在组织工程再生和多种组织修复中展示出令科研工作者印象深刻的治疗广泛性潜能，这种潜能是科研领域毋庸置疑的发展方向。

间充质干细胞(MesenchymalStemCellsMSCs)是一类自我更新和多向分化的能力。来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞。是一种非血源性的多功能干细胞，广泛存在于人体不同组织中，如骨髓、脂肪、牙周膜及脐带，胎盘组织等。近几年来有学者发现其主要来源骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSc)可以自体移植，避免了移植后的免疫排斥。骨髓间充质干细胞的体外扩增比较容易，而且具有跨系或跨胚层分化为不同组织来源细胞的潜能，所以在临床已经应用于中枢神经系统、心血管及免疫系统等多系统疾病的治疗，在癌症和遗传性疾病研究中也有涉及。BMSc可体外诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌母细胞、并在一定的条件下诱导可分化为神经细胞，而且可进行自体移植,避免免疫排斥，被认为是治疗多种疾病的良好细胞来源。也有研究者发现在胎盘组织中也含有丰富的间充质干细胞，提示可以将其提取作为干细胞移植治疗的备选细胞。胎盘间充质干细胞具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干细胞研究的一种理想种子细胞。

骨髓间充质干细胞，在美国FDA已批准在心肌干细胞移植方面进入一期临床试验,国内也开展多个二期临床试验，这充分展示了MSCs的巨大应用前景。不过骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量较少，而且随着年龄的增加，在骨髓中的含量逐渐减少，其增殖分化能力也逐渐减弱；同时骨髓间充质干细胞的取材是有创侵入性操作，增加了捐献者的痛苦和感染的机会，所以骨髓间充质干细胞的临床应用受到了一定的限制；并且病患严重感染、骨髓恶性肿瘤随着年龄的增长骨髓细胞数及增殖、分化能力均明显下降等情况下,患者就无法顺利获得足量可用于治疗的BMSCs,为此很有必要寻找新的MSCs来源。

足月胎盘是分娩的废弃物，取材容易，对供者不造成损伤，无伦理问题，而且胎盘体积大，获得干细胞相对较多，所以胎盘间充质干细胞更方便适用于临床。有学者在叶状绒毛膜组织成功分离培养出胎盘间充质干细胞，并观察其生物学特性和抗凋亡细胞因子血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子的分泌水平，结果证实叶状绒毛膜间充质干细胞的生物学特性与骨髓间充质干细胞相似，并能分泌血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子和肝细胞生长因子。已有研究证实胎盘间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞类似的功能和特性，两者的多向分化潜能也类似。胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层，由间质、血管、滋养细胞组成，含有大量的间充质成分，也含大量的干细胞。叶状绒毛膜含有MSCs,在胎儿出生后多作为废物与一起被丢弃的叶状绒毛膜也含有与骨髓间充质干细胞相似特性的细胞，叶状绒毛膜组织中确含有这些前体细胞，可以极大程度上地解决了干细胞的来源问题。