[发明专利]高效猪组成型启动子及应用

说明书

本发明涉及高效猪组成型启动子及应用。本发明提供的猪组成型启动子，所述启动子来自猪TMSB10基因的‑1893bp～184bp区，其序列选自如SEQ ID NO:1‑7所示的核苷酸序列。本发明还提供猪杂合启动子，其是将所述猪组成型启动子与hCMV增强子融合获得的启动子。本发明首次从猪中克隆获得高效组成型启动子，并成功构建出含有hCMV增强子序列的猪杂合启动子，并对启动子的活性进行了检测。结果表明，猪杂合启动子的活性约为hCMV启动子活性的1.5倍。本发明的启动子可用于猪TMSB10基因的转录调控机制研究，并用于哺乳动物细胞中进行相关蛋白表达及转基因研究，为转基因技术提供技术支持。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种高效猪组成型启动子及应用。

背景技术

猪肉为人类提供优质的动物蛋白和其他营养物质，因此，优良猪种的培育对于推动农业的发展具有重要作用。同时，由于猪在解剖学，生理学和遗传学等方面与人类具有高度相似性，因而被认为是人类异种器官移植的理想供源和人类疾病研究的模式动物。转基因技术可以通过基因工程等技术手段实现对猪的基因组进行上述有目的的可遗传修饰。

启动子是一段脱氧核糖核酸序列，是基因的重要组成部分，能通过与反式作用因子相互作用来调控基因的转录时间和转录程度。真核生物启动子根据发挥作用的时间和空间特异性可分为诱导型启动子、组织特异型启动子和组成型启动子。组成型启动子能够在不同组织和不同细胞中启动目的基因的稳定表达。鉴于启动子启动活性对于目的基因表达水平的这种重要的调控作用，具有高效并持续稳定启动目的基因表达的启动子往往是科研工作者在进行转基因操作时的首选。

目前，转基因技术中常用的启动子包括hCMV、EEF1α、PGK、CAG等，这些启动子虽然在体外都能很好启动外源基因的表达，但都不是宿主来源的启动子，在整合到猪的基因组中之后可能会引发宿主细胞防御机制而失活。因此，高效猪组成型启动子的克隆有着重要的意义。

另外，已有相关报道证明，hCMV增强子可有效增强真核启动子的启动活性，小鼠活体实验中杂合启动子仍能够发挥良好的功能。

目前，尚未有从猪中克隆高效组成型启动子及应用的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供新型猪高效组成型启动子及猪杂合启动子。

本发明的另一目的是提供上述启动子的应用。

本发明基于以下构思：利用Ensemble数据库和NCBI数据库查找猪胸腺素β-10基因(TMSB10)的5’上游调控序列，利用在线真核启动子预测软件NNPP、TSSW、Promoter 2.0、Promoter Scan、FirstEF对该基因的核心启动子区域顺反式作用元件及CpG岛分布情况进行预测。设计一系列引物，从马身猪的基因组中PCR扩增获得相应目的片段，并将目的片段插入报告载体pGL3-basic中构建重组载体，瞬时转染293T细胞，利用β-gal作为参照物检测不同启动子片段的活性。最后在活性和长度都合适的片段前插入了hCMV增强子序列，采用相同的方法对杂合启动子的活性进行了分析，并验证了不同启动子的启动效率。

为了实现本发明目的，本发明提供的猪组成型启动子，所述启动子来自猪TMSB10基因的-1893bp～184bp区，其序列选自如SEQ ID NO:1-7所示的核苷酸序列。

本发明还提供猪杂合启动子，其是将所述猪组成型启动子与hCMV增强子融合获得的启动子。优选是将如SEQ ID NO:5所示的猪组成型启动子与如SEQ ID NO:8所示的hCMV增强子融合获得的启动子。

更优选地，所述猪杂合启动子为PhCMVE-TMSB10，其序列为：

i)SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或