[发明专利]猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种兽医生物技术领域，具体地说是猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及其制备方法，重点用于猪圆环病的抗体监测。

背景技术

猪圆环病毒(PCV)有2个血清型：PCV1和PCV2，其中PCV1对猪的致病性较低，广泛存在于正常猪群和猪源细胞中；而PCV2对猪的危害性极大，能引起多种疾病综合征，如猪断奶后多系统衰竭综合征、皮炎与肾病综合征、繁殖障碍等。此外，该病能对养猪业产生多系统、多阶段、全方位的危害，造成直接或间接的损失。为了更好的控制猪圆环病，就必须及时了解并掌握猪场PCV2(猪圆环病毒2型)的感染情况，而且，新型疫苗的效力检测，也需要简单快速的测定方法作为配套检测技术。

目前，常见的PCV2抗体检测方法有间接免疫荧光(IIF)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。ELISA包括竞争ELISA、间接ELISA、抗原捕获ELISA等。IIF和IPMA较为经典，但对操作要求很高，不便于大量样品检测，ELISA操作简单可靠，特异性好，但需要借助昂贵的仪器。

表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，也是T细胞受体/B细胞受体和抗体特异结合的基本单位，在抗原中起着关键性作用。在机体的免疫系统中，免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个蛋白质分子，仅识别抗原分子上的抗原决定簇，也就是说抗体的特异性是针对抗原表位而不是针对完整的抗原分子的。抗原表位是免疫原抗原性的物质基础，抗原表位的研究对病原的诊断具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及其制备方法，实现快速有效地对猪群PCV2血清抗体进行检测。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条，包括支撑层、加样层、检测层和吸收层；还包括金标蛋白释放垫，所述金标蛋白释放垫包埋有胶体金标记的重组蛋白G；所述检测层上设置有检测带和质控带，检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白上的优势抗原表位肽，质控带固定有ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG；所述优势抗原表位肽序列为ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段。

上述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法包括如下步骤：

S1制备所述优势抗原表位肽；

S2制备ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG；

S3胶体金颗粒的制备，并采用胶体金标记重组蛋白G并用玻璃膜吸附，得到金标蛋白释放垫；

S4制备检测层，步骤S1制备得到的优势抗原表位肽和步骤S2制备得到的ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG分别用硝酸纤维膜包被并分别得到检测带和质控带，构成检测层；

S5将加样层、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层设于支撑层上。

需要说明的是，所述步骤S1的方法具体为：

1.1)根据ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段，设计并合成1对引物：

ORF2-EF：5’-GC GGA TCC CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC T-3’

ORF2-ER：5’-GC CTC GAG TTA GCG GGA GGA GTA GTT TAC A-3’；

引物中分别引入BamHI和XhoI酶切位点；

1.2)以ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段为模板，利用步骤1.1)设计得到的引物对进行PCR处理；

1.3)将ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段在pGEX-4T-1中进行克隆，得到的阳性重组质粒命名为pGEX-ORF2-C；

1.4)将步骤1.3)得到的重组质粒pGEX-ORF2-C转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达，将表达后的蛋白命名为GST-ORF2-C；

1.5)谷胱甘肽亲和层析柱层析法纯化GST-ORF2-C，即得优势抗原表位肽。

进一步需要说明的是，步骤1.2)中，PCR反应条件为：94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。

进一步需要说明的是，步骤1.3)具体方法为：