[发明专利]一种制备重组人凝血八因子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备重组人凝血八因子的方法。

背景技术

A型血友病是由于人体凝血八因子缺乏或者不正常而导致的一种凝血功能障碍疾病，其主要表现是，活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，轻微创伤后即出现出血倾向。凝血八因子在凝血级联反应中作为活化型的九因子的辅因子激活十因子，进而刺激内源性凝血反应的发生。

天然人凝血八因子(FVIII)是一种大分子糖蛋白，由重链和轻链结合而成，总分子量330KD，血浆中含量约0.2mg/L，以结合血管性血友病因子(VWF)的形式存在。重组人FVIII与天然FVIII有相同的生理，药理和免疫特征，并且有杜绝HIV、HDV、蛋白病毒等病源传播的优点，因此，重组FVIII蛋白表达的研究成为A型血友病治疗的一个重要趋势。

目前大规模制备重组八因子的两种方法均有缺陷，血清培养基方法由于需要外源添加动物血清，从而带来了病毒潜在污染的风险。而VWF与FVIII基因的共表达方法，八因子的表达量比较低，细胞株构建方法复杂，达不到产业化需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种安全高效可产业化应用的制备重组人凝血八因子的方法。

本发明的制备重组人凝血八因子的方法包括以下步骤：

(1)构建表达人凝血八因子的细胞株；

(2)将步骤(1)构建的人凝血八因子表达细胞株接种到培养基中，振荡培养一段时间，至细胞密度达到1.5～2.5×10⁶cells/ml，以1:5的传代比例细胞传代，振荡培养至细胞密度达到1.5～2.5×10⁶cells/ml，获得种子液；

(3)将步骤(2)获得的种子液接种到细胞反应器的培养基中，培养一段时间，使细胞液的细胞密度达到2～6×10⁶cells/ml；然后向细胞液中加入外源的血管性血友病因子并对细胞液进行补料培养，获得细胞原液，其中，在所述补料培养过程中，控制细胞液中血管性血友病因子活性与人凝血八因子活性比为2～12:1；

(4)从步骤(3)获得的细胞原液中分离纯化出重组人凝血八因子。

本发明克服了现有技术中为了得到稳定的凝血八因子必须要在同一个细胞株中共表达八因子和VWF的难点。本发明提出了一种有效的细胞培养途径，通过将FVIII和VWF的含量控制在一定的优化范围内，使FVIII的表达被大量累积，并且本发明的制备工艺表达细胞构建难度小，特别适合工业化大量生产重组人凝血八因子。

较佳地，步骤(1)中，所述表达人凝血八因子的细胞株为构建的单独表达人凝血八因子的细胞株，并且表达的FVIII包括全长FVIII和B区有缺失的FVIII片段。

较佳地，步骤(2)和/或步骤(3)中，所述培养基为无血清细胞培养液。

较佳地，步骤(2)中，将步骤(1)构建的人凝血八因子表达细胞株以0.8～9×10⁵cells/ml的接种量进行接种。

较佳地，步骤(2)中，振荡培养的条件为：转速50～140转/分钟，培养温度25～39℃；振荡培养时间为4～5天。

较佳地，步骤(3)中，种子液接种到细胞反应器的接种量为6～12v/v％。

较佳地，步骤(3)中，种子液的培养时间为3～7天。

较佳地，步骤(3)中，所述补料培养的条件为：补料培养过程中控制溶氧50～90％，pH 7～7.5，搅拌转速50～80转/分钟，培养温度32～39℃，根据葡萄糖的消耗来进行补料，使葡萄糖浓度维持在0.6～1.8g/L。

较佳地，步骤(3)中，所述细胞原液的细胞密度为1～2×10⁷cells/ml。

本发明的效果包括：1)本发明不添加外源动物血清，避免了潜在的病毒污染风险。

2)本发明表达人凝血八因子的细胞株构建方法简单，重组人凝血八因子表达量高，适合大规模工业化生产。

具体实施方式

以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明提供了一种利用哺乳动物细胞培养制备重组人凝血八因子的方法，将外源的血管性血友病因子添加到表达重组人凝血八因子的无血清细胞培养液中，并在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为2～12:1。