[发明专利]微囊化免疫细胞冻存与复苏方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种微囊化免疫细胞冻存与复苏方法。

背景技术

细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传统的手术、放疗、化疗的弊端，已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段,也是世界目前唯一有希望完全消灭肿瘤细胞的治疗手段。

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。从血液中分离出来的单个核细胞包括：T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞等，是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，经各类细胞因子诱导扩增培养，得到一群具有高效杀伤活性的免疫细胞群。

常见的免疫细胞治疗种类包括NK细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞、TIL细胞、LAK细胞、CART细胞等。所有这些经诱导和扩增培养的免疫细胞的初始细胞来源都是外周血或脐血的单个核细胞，而且是直接分离培养。随着年龄的增长，免疫细胞在体内的活性也会随之降低，所以在年轻时期冻存具有较高活性的免疫细胞，对于未来罹患肿瘤相关疾病的治疗可以起到很好的保障，因此免疫细胞冻存及冻存后的复苏培养具有非常大的意义。除此之外，随着免疫细胞治疗项目的逐步推广，免疫细胞的远程运输，长期保存问题就凸显出来，也是细胞制备区域化进程中必须解决的问题。

目前，细胞冻存主要是采取-196℃超低温条件下的保存方案，在超低温条件下，细胞的代谢功能停滞，但并未死亡。而细胞复苏则主要采用冻存细胞在37℃快速解冻的方法，以恢复细胞的活性和功能。但是现有的免疫细胞冻存方法适用于冻存干细胞和肿瘤细胞，对于免疫细胞，在冻存过程中则易形成冰晶损伤细胞，复苏后细胞活率低、细胞增殖数量不足、细胞易老化，存在效率低下，冻存质量不高、细胞复苏后活性差以及成活率不高等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中免疫细胞冻存方法存在冻存效率差，且免疫细胞复苏成活率低等缺陷，提供一种能够提高免疫细胞冻存效率并提高免疫细胞复苏成活率的微囊化免疫细胞冻存方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种微囊化免疫细胞冻存方法，包括以下步骤：获取免疫细胞；

将所述免疫细胞与用于制作微囊的囊材混合进行微囊化处理，获得微囊化免疫细胞；

将所述微囊化细胞置于细胞冻存液中进行冻存。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，所述囊材为壳聚糖或海藻酸-聚赖氨酸。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，所述囊材为海藻酸-聚赖氨酸，且所述微囊化处理的过程包括以下步骤：

将所述免疫细胞和海藻酸溶液混合搅拌至免疫细胞浓度为(0.5～2)×10⁷个/ml，逐滴加入氯化钙溶液中，形成凝胶球后，加入聚赖氨酸包埋。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，所述聚赖氨酸包埋的时间为1～12分钟。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，所述聚赖氨酸包埋后，还包括采用有机酸溶液液化微囊的步骤。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，所述细胞冻存液包括二甲基亚砜、人血清和AIM-V培养基。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，；所述AIM-V培养基中，二甲基亚砜的体积分数为5～15％，人血清的体积分数为5～15％。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，所述冻存过程，还包括以下步骤：

将置于所述细胞冻存液中的微囊化免疫细胞温度降至-60～-100℃后，置于-170～-200℃温度下冻存。

本发明进一步保护一种微囊化免疫细胞冻存后的复苏方法，其特征在于，将权利要求1～8任一项所述的冻存后微囊化免疫细胞进行复苏的过程，包括以下步骤：

将冻存后的微囊化免疫细胞以20～40℃/min的速度升温至-100℃，然后置于含有体积分数为20％～40％二甲基亚砜的水溶液中迅速升温至融化。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存后的复苏方法中，微囊化免疫细胞解冻之后，于室温下将微囊化免疫细胞放入磷酸盐缓冲液中稀释，逐步透出二甲基亚砜，离心弃上清，洗涤，加入无血清培养基进行培养。