[发明专利]一种基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法

权利要求书

1.一种基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法，其特征 在于，包括以下步骤：

1)RNA的分离纯化；

2)探针与Marker的放射性标记和标记产物纯化；

3)制胶和电泳；

4)转膜与RNA分子的交联固定；

5)预杂交和杂交；

6)洗杂交膜和低温放射自显影；

7)杂交探针的剥脱与膜的再利用。

2.根据权利要求1所述的基于Northern杂交检测家蚕microRNA 的方法，其特征在于，所述RNA的分离纯化具体按照以下步骤实施：

(1)180℃烘研钵2h，待冷却至室温后放于-20℃冰箱中预冷；

(2)分装Trizol至1.5mL离心管中，1mL/支；

(3)将100μg家蚕组织材料在冰上研磨至白色粉末，需要加3 次液氮；

(4)将粉末转到Trizol中，用移液枪枪头吹吸数次至无明显块 状，静置5min；

(5)加入300μL氯仿，用力振荡混匀20s，静置10min；

(6)4℃条件下12000r/min离心20min，转移上清液约600μL， 加入100μLPEG6000-NaCl混合溶液，15％PEG6000，2mol/LNaCl， 轻轻颠倒混匀，冰上静置10min；

(7)4℃条件下10000r/min离心15min，将上层液体转移到无 RNA酶的1.5mL离心管中，计量液体的体积；

(8)离心管中依次加入1/10体积的pH5.2、3mol/LNaAc、4μ LDNAmate，颠倒数次混匀，再加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻颠 倒数次混匀，-20℃静置2h以上；

(9)4℃条件下13000r/min离心10min，小心将液体倒在废液缸 中，用500μL75％乙醇洗沉淀1次，4℃条件下10000r/min离心2min， 倒掉液体，将残留液体吸出；

(10)在无菌操作台上将沉淀自然风干，时间为5min或在真空 干燥箱中干燥至微透明，时间为2min；

(11)视沉淀量向离心管中加入50～100μL无RNA酶的甲酰 胺溶液，用移液枪枪头将沉淀离散以助溶，于4℃条件下溶解沉淀30 min；

(12)取1～2μLRNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测质量，电泳缓 冲液为l*TBE，100V；

(13)电泳期间吸取1.5μLRNA检测浓度，以1.5μL甲酰胺作 对照；

(14)按照30μL/支将RNA进行分装后，进行PAGE凝胶电泳 及后续操作，也可以加入500无水乙醇于-80℃保存备用。