[发明专利]重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法

权利要求书

1.一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征 在于，所述方法包括以下步骤：

1)重组表达质粒的构建

设计带有EcoRI和NotI酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物， 进行PCR扩增获得目的基因片段，将目的基因片段用限制性内切酶EcoRI酶 和NotI酶进行双酶切，然后将用相同限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切的 质粒pPIC9K与酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶连接，通过热激转 化到大肠杆菌DH5α中培养扩增，提取得到重组表达质粒pPIC9K-lunasin；

2)筛选高抗性重组基因工程菌株

将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经SacI线性化酶切，将经酶切线性化的 重组表达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例混合后，进行电击转化获 得转化子，将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基，经过PCR鉴定及 G418高抗性筛选，阳性克隆为重组工程菌GS115/pPIC9K-lunasin；

3)重组luansin多肽的发酵生产

将上述获得的G418高抗性的阳性克隆重组工程菌株 GS115/pPIC9K-lunasin接种于BMGY培养基中，在30℃下培养直至OD₆₀₀为 2.0-4.0，离心收集细胞，然后将细胞重悬于BMMY培养基中培养直至OD₆₀₀为1.0-2.0，0.5％甲醇诱导表达；经甲醇诱导重组lunasin多肽的发酵液高速离 心除去细胞后，上清液使用Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳，以筛选得到高 表达lunasin多肽的基因工程菌株；

4)重组luansin多肽的分离纯化

将上述筛选得到的高表达重组工程菌株再次发酵生产，得到的发酵液经 高速离心除去菌体后，上清中加入CaCl₂溶液，充分混匀后室温静置5min， 高速离心得到沉淀，该沉淀经真空冷冻干燥得重组lunasin多肽粗产物；

将粗产物以浓度为10mg/mL溶解，使用DEAE阴离子交换柱，根据出峰 时间分部分收集洗脱液，真空干燥后，经Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳， 收集lunasin多肽富集洗脱液，合并后过超滤膜浓缩液。浓缩液经真空冷冻干 燥后得到纯度为93％的重组lunasin多肽。

2.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及 纯化方法，其特征在于，步骤1)中设计带有EcoRI和NotI酶切位点Lunasin 序列为：

GAATTCTCCAAATGGCAGCACCAGCAAGACAGCTGCCGC AAGCAGCTCCAGGGGGTGAACCTCACGCCTTGCGAGAAGCAC ATCATGGAGAAGATCCAAGGCCGCGGCGATGACGATGATGAT GATGACGACGACGCGGCCCTACTACTACTGCTGCTGCGCCGG。

3.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及 纯化方法，其特征在于，步骤1)中特异性扩增引物为：

上游引物：5’-GGAATTCTCCAAATGGCAGCAC-3’，

下游引物：5’-TTGGCCGCGTCGTCGTCATCATC-3’。

4.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及 纯化方法，其特征在于，步骤2)中感受态毕赤酵母GS115制备方法包括以 下步骤：

从YPD平板上挑取一个新鲜的毕赤酵母GS115单克隆至10mlYPD液体 培养基，30℃，250rpm培养过夜；测定过夜培养物的OD₆₀₀值为3.0-5.0之间； 将10mlYPD过夜培养物稀释至OD600值为0.2-0.4；在28-30℃摇床中继续 培养8-12h，使其OD₆₀₀值达到1.0-1.5；于室温1500g离心5min收集酵母细 胞，弃上清；用10ml洗液洗酵母细胞，随后于室温1500g离心5min离心收 集细胞，弃上清；用1ml山梨醇溶液重悬酵母细胞，以每管50μl分装。