[发明专利]一种猪链球菌7种毒力基因筛选液相芯片试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物基因领域，涉及一种细菌的毒力基因筛选液相芯片试剂盒，具体 来说是一种猪链球菌7种毒力基因筛选液相芯片试剂盒。

背景技术

猪链球菌(SS)病是一种严重危害养猪业的人畜共患病，呈世界性分布。其中以1、 2、7、9型最为常见，主要的毒力因子有谷氨酸脱氢酶(gdh)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因 子(epf)、溶血素(sly)、纤连蛋白结合蛋白/纤连蛋白(fpbs)、毒力相关序列(orf2)、甘油 醛-3-磷酸脱氢酶。研究表明，SS致病性强弱与其毒力因子密切相关。其中mrp和epf是强毒 株的标志，sly为一种巯基活化类毒素，在菌体入侵和裂解细胞的过程发挥作用。其他独立 因子均与细菌的致病性有着密切的关系。

目前，针对猪链球菌毒力因子筛选的方法主要是传统PCR方法，但此方法存在检测 效率低、敏感性不强、EB等核酸染色液存在污染等缺点，在筛选大量临床样本时工作量太 大。而且，目前使用的多重PCR筛选方法也只限于4种到5种猪链球菌毒力因子的筛选，已不 能满足对临床菌株毒力因子筛选的需要。随着科技的进步和技术的发展，急需建立一种能 同时检测更多毒力因子的高通量检测方法。近期，美国有报道采用液相芯片试剂盒技术方 法，通过一个反应孔同时对引起呼吸道感染的22种病原体(细菌和病毒)进行筛选，特异性 超过了97％，满足了临床中对呼吸道混合感染诊断的需要。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种猪链球菌7种毒力基因筛选 液相芯片试剂盒，所述的这种猪链球菌7种毒力基因筛选液相芯片试剂盒要解决现有技术 中检测猪链球菌毒力因子筛选方法工作量大、敏感性不强，而且污染严重的技术问题。

本发明在于提供一种猪链球菌7种毒力基因筛选液相芯片试剂盒，其含有：

1)特异性的上游引物探针，所述的特异性的上游引物探针的序列如SEQIDNO： 15-21所示；

2)特异性的下游引物探针，所述的特异性的下游引物探针的序列为SEQIDNO：2、 SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：10、SEQIDNO：12、SEQIDNO：14所 示，在任意一个所述的特异性下游引物探针的5’端加上了一段生物素；

3)特异性微球，所述的特异性微球的序列如SEQIDNO：22-28所示。

进一步的，任意一个特异性上游引物探针中含有一段与微球相互补的TAG标签并 以12C相间隔。

进一步的，任意一个所述的特异性微球的序列和对应的特异性上游引物探针中 TAG标签相互补。

进一步的，还含有1×Tm杂交夜、链霉亲和素。

进一步的，还含有多重PCRMix1、多重PCRMix2，链球菌7个毒力因子筛选液相 芯片试剂盒使用说明书。

本发明的用于猪链球菌7种主要毒力因子筛选液相芯片的试剂盒是一种高通量的 检测技术，集流式细胞仪技术、荧光编码微球、激光、数字信号处理和传统的生化技术于一 体，是一种多功能的分析平台。液相芯片技术的准确性和特异性高，与普通PCR的符合率为 100％。与普通PCR检测相比，本试剂盒不仅具有高通量的优势，可在一个检测孔中同时对猪 链球菌7种毒力因子进行检测，且避免了EB对人的危害，灵敏度高，最低检测浓度可达到 1pg/μL。

本试剂盒采用多重PCR产物作为探针与特异性微球结合，提高了检测的特异性，通 过流式细胞仪和激光扫描技术，最终给出一个MFI值，不仅能够定性还可以对样本进行相对 定量。采用该试剂盒对临床猪链球菌毒力因子进行筛选，对于猪链球菌毒力的检测、流行病 学调查和风险评估具有重要的应用价值。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。采用本发明的试剂盒进行猪链球 菌7种毒力基因筛选的液相芯片时，具有快速、高通量、敏感度高、特异性强等优点，极大的 缩短了实验周期，开拓了该试剂盒的应用前景。

附图说明

图1是液相芯片仪读取数据的原理图。

图2是特异性探针与微球偶联的示意图及原理。

图3是当微球在流动鞘液的推动下通过流式细胞仪，通过两束光对微球表面携带 的信息进行扫面和读取。