[发明专利]猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法

权利要求书

1.用于同时检测猪病毒性腹泻四种病原的液相基因芯片的引物对和探针，其特征在于，包括猪流行性腹泻病毒PEDV、猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪轮状病毒PRoV以及猪源牛病毒性腹泻病毒BVDV的上、下游引物和探针，所有下游引物5’端进行生物素标记，所有探针5’端进行氨基NH₂(CH₂)₁₂修饰，具体序列如下：

BVDV：上游引物BN-F:TTACGACATCAACGGAT；

下游引物BN-R:Biotin-TGGTCCCTAGTCGCTCT；

探针BN-Probe:NH₂(CH₂)₁₂-CCGCAATCCACACTAAAGCTA；

TGEV：上游引物TGEV-F3:AACAGGGATCAACAGATT；

下游引物TGEV-R3:Biotin-TAGTAGAAGAACCACCT；

探针TGEV-Probe:NH₂(CH₂)₁₂-CAAACTCGCTATCGCATGG；

PEDV：上游引物PEDV-F:GATACTTTGGCCTCTTGTGT；

下游引物PEDV-R:Biotin-ATTGACTTACCTGTACGC；

探针PM1-Probe:NH₂(CH₂)₁₂-CGCAGGACACATTCTTGGT；

PRoV：上游引物PVP6-F3:ATTTATATTYCATGCTAC；

下游引物PVP6-R3:Biotin-CTGTCCAATTCATYCCT；

探针PVP6-Probe:NH₂(CH₂)₁₂-TTTGTGAATCTGTGCTTG。

2.一种区分BVDV、TGEV、PEDV和PRoV病毒的液相芯片检测方法，用于非疾病的诊断与治疗目的，包括如下步骤：

1)以提取待测样品中的RNA作为模板，反转录得到cDNA；

2)分别针对病毒BVDV的N^pro基因、TGEV的N基因、PEDV的M基因、PRoV的VP6基因序列设计、合成相应的如权利要求1所述的上、下游引物，探针；

3)微球与探针进行偶联

选用不同颜色编码的微球分别偶联BVDV的探针BN-Probe、TGEV的探针TGEV-Probe、PEDV的探针PM1-Probe、PRoV的探针PVP6-Probe，将得到的四种偶联到微球的探针进行混合，得到偶联到微球的探针混合物，备用；

4)杂交

以步骤1)得到的cDNA为模板，用步骤2)合成的上、下游引物分别进行PCR扩增，得到生物素化的扩增产物；

将所述生物素化的扩增产物与步骤3)得到的偶联到微球上的探针混合物进行杂交；

5)检测

对步骤4)得到的杂交产物进行液相芯片检测，根据平均中位荧光强度值MFI判定检测结果：

若待测样品相应病毒的MFI与阴性对照的MFI的比值≥3，则待测样品判定为该病毒阳性；

若2≤待测样品相应病毒的MFI与阴性对照的MFI的比值＜3，则待测样品判定为该病毒疑似阳性；

若待测样品相应病毒的MFI与阴性对照的MFI的比值＜2，则待测样品判定为该病毒阴性。

3.根据权利要求2所述的液相芯片检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述微球是直径为6.5μM的磁性微球。

4.根据权利要求2所述的液相芯片检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述PCR扩增的扩增体系中上、下游引物的质量比为1：1～8。

5.根据权利要求2或4所述的液相芯片检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述PCR扩增的扩增体系中上、下游引物的浓度≥5μM。

6.根据权利要求2所述的液相芯片检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述PCR扩增的扩增反应程序中退火温度为50～56℃。