[发明专利]一种检测人H3F3A基因突变的探针法及检测试剂盒

权利要求书

1.一种检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，其特征在于，包括H3F3AK27MPCR反应混合液，其中所述H3F3AK27MPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的H3F3AK27M上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的H3F3AK27M下游引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的H3F3AK27M探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针。

2.根据权利要求1所述的检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，其特征在于，所述H3F3AK27MPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述H3F3AK27M上游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述H3F3AK27M下游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述H3F3AK27M探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。

3.根据权利要求1或2所述的检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，其特征在于，所述H3F3AK27MPCR反应混合液的PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。

4.根据权利要求1-3之一所述的检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括弱阳性对照液和/或空白对照液。

5.根据权利要求4所述的检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，其特征在于，所述弱阳性对照液为H3F3AK27M突变率为10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有H3F3AK27M突变的阳性质粒溶解在没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，所述阳性质粒与没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所述空白对照液是TE缓冲液。

6.一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在H3F3AK27MPCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成H3F3AK27M反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：

所述H3F3AK27MPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的H3F3AK27M上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的H3F3AK27M下游引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的H3F3AK27M探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；

(2)结果判断：根据人类基因组DNA在K27M反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值进行分析。

7.根据权利要求6所述的检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，所述H3F3AK27M反应体系为：在16-20μlH3F3AK27MPCR反应混合液中加入1-4μl、浓度为2-10ng/μl的人类基因组DNA，优选在18μlH3F3AK27MPCR反应混合液中加入2μl、浓度为10ng/μl的人类基因组DNA；所述H3F3AK27MPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述H3F3AK27M上游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述H3F3AK27M下游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述H3F3AK27M探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。