[发明专利]一种抑制鸡B淋巴细胞CD86基因表达的siRNA及其应用

说明书

本发明公开了一种抑制鸡B淋巴细胞CD86基因表达的siRNA及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明根据鸡B淋巴细胞CD86mRNA序列设计并合成小分子干扰RNA(序列如SEQ ID NO:1～2所示)，该CD86siRNA能有效抑制鸡DT40细胞CD86mRNA与CD86蛋白的表达，在干扰鸡CD86基因表达后，法氏囊活性肽囊素促鸡DT40细胞表面膜IgM(mIgM)抗体mRNA的表达水平显著降低，其在制备抗禽B淋巴细胞活化(或发育分化)的免疫抑制剂方面具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种抑制鸡B淋巴细胞CD86基因表达的siRNA，同时还涉及该siRNA的应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

1993年Boissoptis等发现了B7家族的第二个成员CD86(B7-2)分子，同年Freeman等克隆出了CD86的基因。CD86是表达在抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)表面的共同刺激性配体，是免疫超家族成员之一。CD86由1120bp基因所编码，其基因序列与CD80有26％的同源性，其中包含一个由981个核苷酸组成的开放阅读框，氨基端有一个分泌性信号肽，推测其整个蛋白由306个氨基酸组成，属于I型跨膜糖蛋白。修饰之前CD86的分子量约为34kD，包含一个由220个氨基酸组成的胞膜外区，一个由23个氨基酸组成的疏水性跨膜区和一个由60个氨基酸组成的胞浆区。其中，胞膜外区包含一个免疫球蛋白超家族V样区和C样区，含有8个潜在的N连接糖基化位点；胞浆区有PKC和酪蛋白激酶II的潜在磷酸化位点，提示CD86可能有信号转导功能。CD86可以在各种APC表面以单体的形式表达，如树突状细胞(DC)、朗格汉斯细胞、活化的巨噬细胞、B细胞等，其一般呈低水平组成性表达，活化后可快速上调。

CD86可以与T细胞共刺激受体CD28和细胞毒性T细胞相关抗原4(cytotoxic Tlymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)结合。CD86与CD28/CTLA-4结合后，与CD80协同刺激CD4⁺Th1和Th2型细胞的表达，且对Th2型T细胞的作用大于Th1型。Th1型细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等I型细胞因子，参与细胞毒性T细胞(CTL)介导的细胞免疫，Th2型细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等II型细胞因子，其功能在于刺激B细胞增殖及嗜酸性粒细胞活化，促进抗体(IgG、IgE)的产生，参与体液免疫。总之，CD86在调节机体免疫应答中具有重要作用。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象，也称依赖于RNA的基因沉默机制，是指由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的特异性抑制与其序列同源的靶基因mRNA表达的现象。2001年Elbashir等在哺乳动物细胞中首次观测到RNAi现象，由于RNAi技术易于制备特定基因缺失表型个体，可方便快捷地研究该基因的功能，因而被广泛应用于基因功能和基因治疗研究领域。研究发现，小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)能在哺乳动物细胞中诱导特异性基因沉默。

siRNA具有RNA双链结构和3’端双核苷酸悬垂，较难被核酶降解，作为基因沉默工具具有较好的稳定性和优越的抑制效果，已被广泛应用于功能基因组学研究。DT40细胞由禽白血病病毒(avian leucosis virus，ALV)诱导分化，来源于鸡前B淋巴细胞的一个肿瘤细胞系，该细胞表面携带mIgM，并且具有与鸡法氏囊前B淋巴细胞完全相同的生物学特征，因此可以作为良好的禽B淋巴细胞模型开展相关的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制鸡B淋巴细胞CD86基因表达的siRNA。

同时，本发明还提供一种CD86siRNA的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：