[发明专利]基于核酸适体荧光探针AFP2的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检验测定技术领域，特别是涉及基于核酸适体荧光探针AFP2的甲 胎蛋白试剂盒及其检测方法。

背景技术

甲胎蛋白（AFP）是一种糖蛋白，正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎 儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微 克/升。甲胎蛋白在产妇羊水或母体血浆中AFP可用于胎儿产前监测。如在神经管缺损、脊柱 裂、无脑儿等时，AFP可由开放的神经管进入羊水而导致其在羊水中含量显著升高。胎儿在 宫腔内死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可经羊水部分进入母体血循环。 在85%脊柱裂及无脑儿的母体，血浆AFP在妊娠16-18周可见升高而有诊断价值，但必须与临 床经验结合，以免出现假阳性的错误。

检测甲胎蛋白的方法有好几种，放射免疫法测得的甲胎蛋白大于甲胎蛋白500 微克/升、且持续4周者，或甲胎蛋白在200～500微克/升、持续8周者，在排除其它引起甲胎 蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌症后，需再结合定位检 查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出诊断。不过，正常怀孕的妇女、少数肝 炎和肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等情况下甲胎蛋白也会升高，但升高的幅度不如肝癌那样高。 肝硬化病人血清甲胎蛋白浓度多在25～200微克/升之间，一般在2个月内随病情的好转而 下降，多数不会超过2个月；同时伴有转氨酶升高，当转氨酶下降后甲胎蛋白也随之下降，血 清甲胎蛋白浓度常与转氨酶呈平行关系。如果甲胎蛋白浓度在500微克/升以上，虽有转 氨酶升高，但肝癌的可能性大，转氨酶下降或稳定，而甲胎蛋白上升，也应高度怀疑肝癌。

甲胎蛋白在肝癌出现症状之前的8个月就已经升高，此时大多数肝癌病人仍无明 显症状，肿瘤也较小，这部分患者经过手术治疗后，预后可得到明显改善，故肝硬化、慢性肝 炎病人、家族中有肝癌患者的人应半年检测一次。

目前没有能够直接识别甲胎蛋白的抗体和其它分子探针。因此设计一种高度设别 甲胎蛋白的分子探针，并基于此建立简单快速和廉价的检测方法将提高对肝癌和胎儿先天 病等于甲胎蛋白相关的疾病的的监控。

核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分，是指能够高特异性和高亲和力地 域靶分子结的单链核苷酸分子。核酸适体可以通过配体指数富集系统进化技术 （SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX）筛选获得。 SELEX技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机 序列组成)文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过 程),并结合体外扩增技术,经过多轮的循环选择富集,获得与靶物质高度特异结合的寡 核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,长度一般为25~60个核苷酸。核酸适体主要通过 发生适应性折叠，通过氢键、疏水堆积作用、范德华力与靶分子相互作用，与插入或包被的 靶分子形成稳定的三维空间结构。核酸适体不与靶分子结合时，核酸适体处于比较松散的 结构，5'和3'两端相互游离。与靶分子结合时，靶分子诱导核酸适体结构发生改变，核酸 适体的5'端和3'端都将参与与靶分子特定区域（类似于与抗体结合的抗原位点）的相互 作用，导致5'和3'两端相互靠近。这一特点使核酸适体适于分子信标探针设计。其中一种 分子信标设计利用了荧光染料芘分子。当一个激发态芘分子和另一个基态芘分子近距离遭 遇的时候能形成激发态二聚体，能在比芘单体波长更长的位置释放一个光子。芘激发态二 聚体发射峰在480到500nm，而芘单体的发射峰在370到400nm之间。另外，芘分子荧 光寿命比生物样品中的非特异激发荧光的寿命长，检测时可以在非特异激发荧光消失后， 再来收集激发态二聚体的荧光信号，大大提高检测的特异性和灵敏度。识别甲胎蛋白的核 酸适体可以应用于甲胎蛋白的临床检测，提高检测效率，降低检测成本。

核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性,使其在疾病诊断中具有 良好的应用前景,尽管目前成熟的临床应用报道较少,但应用适体检测靶蛋白的研究却 不断增多,基于适体的检测新技术也不断出现。核酸适体由于其独特的化学抗体特性成为 新一代针对特定蛋白的分子药物或靶向载体，以及用于检测其特异性识别的靶分子物质。 但是目前基于核酸适体的针对于甲胎蛋白AFP诊断试剂还很缺乏，且针对于甲胎蛋白AFP的 核酸适体荧光探针检测试剂盒的开发尚未见有报道。

发明内容