[发明专利]一种去除构树叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质分离检测领域，涉及一种去除构树叶片蛋白质中RuBisco蛋白 的方法。

背景技术

构树是一种多功能综合性树种，整个植株都具有开发潜力。其叶片含有丰富的粗 蛋白、粗脂肪和粗纤维等营养成分，可以部分替代豆粕、麦麸等常规饲料，用于猪、 牛、羊等家畜养殖。在我国饲料行业的配方技术结构仍以玉米-豆粕型为主。豆粕、玉 米等大宗原料对外依存度越来越高，受国际市场影响愈来愈大。因此，如何突破现有 的配方技术，开发新的原料和替代品，成为增强企业综合实力，提高竞争力的重要挑 战。构树叶片正是解决这一问题的关键。2015年构树扶贫以列为国务院十大精准扶贫 项目之一。

双向凝胶电泳技术作为研究植物蛋白质组的重要手段，为生物技术手段进行品种 改良提供重要理论依据。在双向凝胶电泳技术(2-DE)中，RuBisco这种超高丰度的 蛋白会严重限制低丰度蛋白的检测。主要有三方面的影响：一方面蛋白上样量有限， 低丰度蛋白因为含量太少在后续的染色过程中不能显现；另一方面是RuBisco的位置 效应，RuBisco蛋白会掩盖周围的低丰度蛋白；第三是在双向上整体干扰其它蛋白的 正常电泳分离，其周围蛋白点的泳道变化最为明显。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法。

本发明所提供的去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法，是利用浓度为 300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白。

进一步，所述去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法，可包括如下步骤：

(1)将植物叶片放入GMⅠ匀浆液中研磨后得到第一匀浆，将GMⅡ匀浆液加入 到所述第一匀浆中研磨后得到第二匀浆；

所述GMⅠ匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mMTris-HCl缓冲液，溶质及 浓度为：15-25mMMgCl₂和0.8-1.2mMPMSF；

所述GMⅡ匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mMTris-HCl缓冲液，溶质及 浓度为：15-25mMMgCl₂、0.8-1.2mMPMSF和3-5％(体积百分含量)NonidetP-40；

其中，pH值为7-9的400-600mMTris-HCl缓冲液为本领域常规表示方法，指 400-600mMTris溶液用HCl调pH至7-9的缓冲液。

(2)将所述第二匀浆于4℃8000-12000g离心5min-15min，取上清，记为第一 上清液；

(3)向所述第一上清液中加入等体积的浓度为300-500g/L(如400g/L)的PEG4000 溶液(溶剂为去离子水)，冰上静置20min-40min，于4℃8000-12000g离心 5min-15min，取上清，记为第二上清液；

(4)向所述第二上清液中加入所述第二上清液1/4体积的浓度为400-600g/L(如 500g/L)的三氯乙酸(TCA)溶液(溶剂为去离子水)，冰上静置30min-50min，于4 ℃8000-12000g离心5min-15min，弃上清，得蛋白粗沉淀；

(5)向所述蛋白粗沉淀中加入4℃预冷的溶液A，于4℃8000-12000g离心 5min-15min，弃上清，得沉淀，完成一次洗涤；重复所述洗涤的步骤至少一次，最后 一次所得沉淀即为去除了RuBisco蛋白的植物叶片蛋白；

所述溶液A的溶剂为丙酮，溶质及浓度为10g/L二硫苏糖醇(DTT)。

在所述方法的步骤(1)中，所述植物叶片、所述GMⅠ匀浆液与所述GMⅡ匀浆 液的使用配比可为0.5g：500-700μL：500-700μL。步骤(1)中所述植物叶片与步骤(3) 中所述PEG4000溶液的使用配比可为0.5g：1000-2000μL。步骤(1)中所述植物叶片 与步骤(4)中所述三氯乙酸(TCA)溶液的使用配比可为0.5g：400-600μL。步骤(5) 中，进行所述洗涤时，所述蛋白粗沉淀与所述溶液A的体积配比可为1：(3-5)。