[发明专利]一种铅镉复合污染土壤综合生物修复方法

权利要求书

1.一种铅镉复合污染土壤综合生物修复方法，其特征在于：针对铅镉复合污染的土壤，以超累积植物修复为主，辅以能够提高植物修复效果的微生物修复和动物修复，增强土壤中铅、镉的生物有效性并由此促进植物的生长和吸收，提高污染土壤修复的综合效率；

首先测定土壤的污染程度，并将土壤污染程度划定为轻度污染、中度污染或重度污染；如果土壤属于轻度污染，则采用植物修复方式或者采用植物修复加动物修复加微生物修复的联合修复方式；如果土壤属于中度污染，则采用植物修复方式或者采用植物修复加动物修复加微生物修复的联合修复方式；如果土壤属于重度污染，则采用植物修复加动物修复加微生物修复的联合修复方式；

所述土壤污染程度的划定方法如下：对土壤中的铅含量进行测定，如果铅含量不超过300mg/kg，则划定为轻度污染，如果铅含量大于300mg/kg且不超过600mg/kg，则划定为中度污染，如果铅含量大于600mg/kg，则划定为重度污染；

所述植物修复采用苏丹草，所述动物修复采用蚯蚓，所述微生物修复采用含有硫细菌、硝化菌、氨化细菌和固氮菌的复合菌剂；所述植物、动物、微生物联合修复的操作步骤为：在苏丹草播种前，保持土壤湿度50%-70%将复合菌剂浅翻3-5cm混匀施入土壤；然后待苏丹草苗出齐后，温度在18-25℃且土壤湿度在50%-70%时投放蚯蚓；

所述植物修复采用转基因苏丹草品种；

所述转基因苏丹草品种的制备步骤包括：

A、受体的制备：选取饱满整齐的苏丹草种子，用自来水冲洗干净，1%的NaCLO消毒10min,将种子摆放在经过高压灭菌且带有两层滤纸的直径90 mm培养皿中，加7ml无菌水，在25℃条件下暗培养2-3d；当茎上的幼芽长度达到0.5cm时，用手术刀片削去胚芽鞘和部分叶片暴露出生长点后放入铺有干燥滤纸的平皿中，室温放置5min用灭过菌的滤纸条吸走茎尖溢出的水分后，室温再放置20min；

B、受体的侵染与共培养：将Takara公司合成的TCMT3基因DNA片段通过了中间载体pAHC25在TCMT3基因两端加上ubi-1启动子和nos终止子，然后再构建于含有T序列的质粒Pcambia0390中，最终转化到农杆菌菌株EHA105中；设计检验外源基因TCMT3的特异引物对转化体进行检测，最后利用“微创伤芽生长点农杆菌转化技术”向苏丹草芽生长点导入外源基因TCMT3；用无菌Tip头挑取单菌落的农杆菌，接入含有抗生素的液体LB培养基中，于28℃、220 rpm条件下培养至菌液浓度为OD600=0.6，4,000rpm、5min离心收集菌体，重新悬浮于原菌液体积的3倍侵染液中，此侵染液含100μmol/L AS、100mg/L F68， 1/10MS盐，1%葡萄糖，4%麦芽糖，PH=5.6；用转基因刷蘸取侵染液对准生长点刺刷两到三次后，摆放在直径90mm的无菌培养皿中，此无菌培养皿加有灭菌滤纸2层、无菌水0.5ml，置于24-25℃条件下暗培养2-3d；

C、转化苗的培养与管理：共培养结束后，将受体转入装有蛭石土的培养钵内，于20℃、16h/d的光照培养箱中培养7d后移栽温室，成熟后单株收获，只收获主穗；

D、转化后代的筛选：将收获的材料每个主穗分别随机选取30粒种入培养钵中，放入温室；当幼苗长至一叶一心时，用20mg/LPPT涂抹叶片，7 d后，拔除非抗性苗，将抗性苗移栽入花盆中，进一步对外源基因进行分子检测以确定转基因苗。