[发明专利]一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1），人胎盘组织的采集：人胎盘组织娩出后，用生理盐水对胎盘组织进行清洗以除去胎盘组织周围的血液和胎粪，然后将胎盘组织浸在胎盘保护液中，暂存于2-8℃环境中；

所述的胎盘保护液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养基；

步骤（2），绒毛膜组织的剥离：在无菌环境下，将步骤（1）得到的浸在胎盘保护液中的胎盘组织的靠近胎儿一侧的胎盘面朝上，然后剥离羊膜并暴露出羊膜下层的绒毛膜层，接着剪取脐带周围的绒毛膜层，并将剪取得到的绒毛膜组织置于0.9%氯化钠注射液中；

步骤（3），绒毛膜组织的洗涤与消毒：先用0.9%氯化钠注射液漂洗步骤（2）得到的绒毛膜组织以去除血液，并用镊子剥去毛细血管，再用含有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的0.9%氯化钠注射液浸泡绒毛膜组织，接着用甲硝唑注射液浸泡绒毛膜组织，浸泡时间均为5-10分钟，最后再用0.9%氯化钠注射液清洗绒毛膜以去除残留的青霉素、链霉素和甲硝唑注射液；

步骤（4），绒毛膜组织的剪碎：将经步骤（3）清洗得到的绒毛膜组织放入无菌容器内，并加入间充质干细胞无血清培养基，按照每10g绒毛膜组织加入1-2ml间充质干细胞无血清培养基，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成1mm³大小的组织块；

步骤（5），人绒毛膜间充质干细胞原代培养：将步骤（4）得到的绒毛膜组织块均匀的平铺于细胞培养瓶中，然后置于细胞培养箱内静置30-60min，之后向细胞培养瓶中添加间充质干细胞无血清培养基，使培养基刚好没过绒毛膜组织块，接着于5%CO₂、37℃的细胞培养箱中静止培养，6-8天后，可见组织块周围有细胞长出，即人绒毛膜间充质干细胞；

步骤（6），人绒毛膜间充质干细胞传代培养：待长出细胞汇合率达50-60%时对人绒毛膜间充质干细胞进行传代培养，弃培养基，加入重组细胞胰酶溶液消化细胞，待细胞消化完全后，加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基，以终止重组细胞胰酶作用，然后离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，并移至新的培养瓶中置于5%CO₂、37℃的细胞培养箱中培养；

步骤（7），人绒毛膜间充质干细胞的冻存：当步骤（6）培养的细胞汇合率达90%后进行细胞冻存，先用重组细胞胰酶溶液将细胞消化成单个细胞后，再加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基终止重组细胞胰酶溶液作用，离心去除上清液，用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，重悬混匀后，将重悬溶液置于冻存管中；

步骤（8），冻存细胞缓慢降温：将步骤（7）得到的冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，-80℃冰箱过夜放置，第二天转入-196℃液氮罐中长期储存；

步骤（9），冻存细胞的复苏：从步骤（8）的液氮罐中取出冻存管后，置于37℃水浴锅中迅速融化，1200-1800rpm离心5min，去除含有冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，加间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并将重悬溶液移至细胞培养瓶中，于5%CO₂、37℃细胞培养箱静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，然后更换新的间充质干细胞无血清培养基，于5%CO₂、37℃细胞培养箱继续培养。

2.根据权利要求1所述的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（1）所述的暂存于2-8℃环境中的时间不能超过24h。

3.根据权利要求1所述的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（7）所述的冻存保护剂为DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液。

4.根据权利要求1所述的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（7）所述的将重悬溶液置于冻存管中时，采用规格为2ml的冻存管，每个冻存管中加入重悬溶液1.5-1.8ml。

5.根据权利要求1所述的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（6）和步骤（7）中用重组细胞胰酶溶液消化细胞前，先用PBS清洗细胞以除去培养基。