[发明专利]针对哺乳动物R‑Spondin1基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种针对哺乳动物R-Spondin1基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用。

背景技术

肝纤维化是肝脏对各种原因所致慢性肝损伤的创伤愈合反应，导致肝小叶内和汇管区大量纤维组织增生和沉淀，病理学特点是以胶原蛋白为主的细胞外基质各种成分合成增多，降解相对不足，但并未形成小叶内间隔，如进一步则发展成肝硬化。肝纤维化是可逆的过程，对肝纤维化的预防和早期干预是稳定病情、阻止肝纤维化向肝硬化和肝癌发展的最佳措施。

肝星状细胞是肝脏合成细胞外基质的主要细胞，其激活发生肌成纤维细胞的表型转换是肝纤维化发生的中心环节。肝星状细胞的激活受众多细胞因子的调控，现有研究结果证实Wnt信号通路影响肝星状细胞的活化，阻断Wnt信号通路可抑制肝星状细胞的增殖及诱导其凋亡。但Wnt信号通路参与了多种生物学过程，包括细胞形态与功能的分化及维持、免疫、细胞癌变与凋亡，直接阻断该信号通路可能具有广泛的不良生物学效应。R-脊椎蛋白1(R-Spondin1)是新发现的Wnt信号通路的重要调控因子，R-Spondin1可以激活并增强Wnt/β-catenin信号通路，在生物体的组织分化、器官形成以及疾病发生过程中发挥重要作用。

RNA干扰(RNAi)是利用序列特异性的、与靶基因同源的双链RNA(dsRNA)对靶基因转录后的信使RNA(mRNA)的分解，从而抑制靶基因表达的一种转录后基因沉默技术。其作用机制是：dsRNA被Dicer酶识别，并被切割为小干扰RNA(siRNA)。siRNA与RNA介导沉默复合体(RISC)结合后，识别并降解同源的mRNA，特异性抑制目的基因的表达。由于RNA干扰抑制靶基因表达具有特异性强、快速、高效等优点，尤其适合特异靶向性的基因治疗。

最初RNA干扰采样体外合成siRNA的方法，但存在转染效率低、转移到细胞内的siRNA不能持久性表达、对靶基因表达的抑制作用短暂等缺点，从而限制了其应用。将siRNA合成为短发卡RNA(shRNA)并由载体导入细胞，能在细胞内稳定的转录生成shRNA，并进一步加工生成靶基因特异性的siRNA，可以发挥长期抑制靶基因表达的作用。

发明内容

本发明的目的是基于RNA干扰技术抑制R-Spondin1基因表达，使激活的肝星状细胞回退到静止状态或凋亡，从而有效促进肝纤维化的恢复过程。

本发明采用的技术方案如下：

根据GeneBank公布的人R-Spondin1蛋白基因的cDNA序列，应用siRNA设计原则，设计siRNA-R-Spondin1序列，经Blast比对，序列的特异性好。所述siRNA设计原则包括：靶位点在AA序列之后，GC碱基含量大于45％，长度在19-23个bp等。

基于上述原则设计的一种针对哺乳动物R-Spondin1基因靶点的小干扰RNA(siRNA-R-Spondin1)，包含正义链和反义链，其中：

正义链序列为5`-GCCAUAACUUCUGCACCAA-3`，如SEQ ID NO：1所示；

反义链序列为5`-UUGGUGCAGAAGUUAUGGC-3`，如SEQ ID NO：2所示。

所述的哺乳动物为人。

一种所述的小干扰RNA的用途，即所述的小干扰RNA通过化学合成法合成短发卡RNA。

根据所述siRNA-R-Spondin1序列，应用shRNA设计原则，设计shRNA-R-Spondin1序列。所述shRNA-R-Spondin1的两端带Hind III和BamH I酶切位点，中间loop接头序列为5`-TCAAGAG-3`，尾部带有RNA聚合酶III终止子TTTTTT。所述的shRNA设计原则包括：序列5`端带限制性酶切位点，酶 切位点下方紧连一个C，目的序列的第一个碱基为G，loop接头序列应在shRNA序列中间，不能出现连续3个以上的T。

本发明的另一目的在于提供一种由所述的小干扰RNA合成的短发卡RNA(shRNA-R-Spondin1)，包含正义链和反义链，其中：

正义链序列为

5`-GATCCCCGCCATAACTTCTGCACCAATCAAGAGTTGGTGCAGAAGTTATGGCTTTTTTGGAAA-3`，如SEQ ID NO：3所示；

反义链序列为