[发明专利]表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株及其所表达的蛋白和用途

说明书

本发明公开了一种表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株及其所表达的蛋白和用途。本发明所述的重组酵母菌株，含有经优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列，其能够高效表达VP2蛋白，且表达的重组VP2蛋白可以自我组装成病毒样颗粒。将本发明重组酵母菌株所表达的鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒蛋白制成疫苗免疫鸡，实验结果表明：本发明蛋白亚单位疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答，使免疫鸡获得100％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻击的保护，并可清除体内残留的病毒，达到清除性免疫的目的。因此，本发明的提出为鸡传染性法氏囊病的防治提供了一种新的技术手段。

技术领域

本发明涉及一种重组酵母菌株及其所表达的蛋白和用途，特别涉及一种表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的重组酵母菌株，还涉及由该酵母菌株所表达得到的鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒及其在预防鸡传染性法氏囊病中的用途。本发明属于医学或兽医学技术领域。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的能够引起鸡体免疫抑制的重要的病毒病，严重危害着世界的养鸡业。传统疫苗在防治该病的历史中起到非常重要的作用，随着该病近年来呈现的新的变化-血清型变异株，超强毒株的出现，使得对该病的防治越来越棘手，传统疫苗的研制速度已经有些难于跟上该病的变化。快速的开发新型有效的能防治变异和超强毒株的新型疫苗的要求尤为迫切。蛋白亚单位基因工程疫苗是去除遗传物质但又保留病毒抗原性的安全疫苗，不存在散毒的危险。该疫苗的开发和应用将为防治当前流行的鸡传染性法氏囊病提供有效的工具和手段，并可为防治禽类免疫抑制病提供有效的参考和经验。

甲醇酵母(Pichia pastoris)表达系统是近几年发展起来的一个真核表达系统，它不仅像原核生物一样操作简便、容易培养、生长快速、成本低廉、适于大规模工业化发酵生产，而且能对重组蛋白进行正确的折叠和翻译后加工修饰，如糖基化、甲基化以及β-折叠等。酵母表达系统是所有表达系统中表达量最高的，可以达到克/升以上，有的表达量高达12克/升。酵母表达载体有分泌型和非分泌型，分泌型可以将所表达的蛋白分泌到液体培养基中去，且酵母本身分泌的蛋白非常少，杂蛋白非常少，易于纯化。Pichia pastoris具有可利用甲醇作为碳源和能源等独特的优势，被认为是分泌表达或非分泌表达外源基因的一种优秀工程菌。

Jagadish等用不同载体在酵母中表达了IBDV的大片段，结果表明，以非融合蛋白形式表达的多聚蛋白经翻译后或翻译过程中的加工，可产生正确的VP3，但检测不到VP2。但以融合蛋白形式表达的蛋白前体可产生稳定的VP2和VP3，说明在表达的多聚蛋白的N末端需要有部分酵母蛋白序列的保护，否则可能会被蛋白酶水解。Macreadie等用酵母表达了IBDV大片段。用转化的酵母裂解液100-200μL(相当于50μgVP2)与弗氏不完全佐剂乳化后注射SPF鸡，可刺激产生很高的ELISA抗体和中和抗体。用1mL免疫鸡的血清腹腔注射1日龄雏鸡，第二天用100CID₅₀的IBDV攻毒，三天后检测法氏囊含毒量。结果表明，免疫鸡血清可对雏鸡提供很好的保护。Fahey等用酵母表达了IBDV VP2，制成油佐剂苗后免疫10周龄SPF鸡。免疫2周后可检测到抗体，然后持续上升，免疫后6周ELISA抗体滴度达高峰，中和抗体效价8周后达到高峰。但以上这些疫苗只能提供临床保护，并不能提供很好的组织病理学保护，也不能清除体内的病毒，无法达到消除免疫的目的。

本发明通过重组酵母菌株表达改造后的鸡传染性法氏囊病毒VP2基因，其表达的重组VP2蛋白可自我组装成病毒样颗粒(VLP)，动物免疫攻毒实验结果表明，本发明的鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒可以实现消除性免疫。在生产工艺上，本发明的重组酵母菌株可以通过发酵培养高表达鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒，比起用SPF鸡法氏囊或细胞培养物制备的传统IBD疫苗，酵母菌的培养简单、方便，所需培养基价格也较低，表达产物经过粗提即可使用，适合大规模生产。因此，用酵母表达生产的IBD亚单位苗将具有更好的应用前景。

发明内容