[发明专利]早实枳miR172家族基因的分离及在植物成花调控中的应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及早实枳miR172家族基因的分离及在植物成花调控中的应用。本发明分离到早实枳miR172基因家族中的3个成员，分别命名为PtmiR172a、PtmiR172b和PtmiR172c，它们的核苷酸序列依次为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，长度分别为212bp、305bp和298bp。遗传转化烟草后，PtmiR172a、PtmiR172b和PtmiR172c均明显地缩短了烟草的营养生长期，促进烟草早花。这些基因对于加快多年生木本果树的育种和遗传改良将发挥重要的作用。

背景技术

开花结实是植物生命周期中重要的生物学过程，是植物自身发育过程的中心环节，也是果树生产及果业产品加工的基础。大部分的木本果树均为多年生的植物，从种子播种、萌发到具备正常的开花能力，需要经历一个漫长的阶段，即童期(Cervera et al.1998)。不同种类的果树童期长短不同，桃三李四橘八年，而像银杏等实生繁殖树从播种到开花则需更长时间(Pena et al.2001)。木本果树一般体积大、遗传背景复杂、童期相对较长等原因，很大程度上制约了多年生果树，尤其是以收获生殖器官为主的果树和经济林木的育种进程及新品种的推广。因此，揭示木本植物从营养生长到生殖生长转变的分子机制，对于果树品种改良及花期调控有着重要的理论意义和实践价值。

植物成花是其成功进入生殖阶段的标志，目前在拟南芥中发现有五条主要调控植物成花的途径：光周期途径、春化途径、GA途径、自主途径和年龄途径(Khan et al.2014)。microRNAs(miRNAs)是一类大小只有21-24nt的单链小分子RNA，是动植物中最重要的基因表达调控因素之一，通过特异地降解或者抑制靶基因的翻译来调控基因的表达(Nozawa et al.2012)。近年来的研究发现，miR156和miR172在植物由营养生长向生殖生长的转变期扮演着关键的角色，二者可以靶定目标基因的DNA转录因子起作用(Lauter et al.2005)。miR156在植物幼年期呈现很高的表达量，在进入成年期后含量逐渐降低，而miR172有着相反的表达模式(Fornara et al.2009)，这表明miR156和miR172有着互补的调节关系。miR156的过表达可以对SPL基因造成负调控作用，推迟幼年期向成年期和成年期向生殖期的转变(Khan et al.2014；Wu et al.2009)。SPL基因是多个成花信号调控并形成年龄成花途径的分子输出通道(Wang et al.2009)。在拟南芥中，miR172对成花的调控机制已有较多报道，主要通过调控AP2和AP2-like基因的转录水平来调节植物的成花(Mathieu et al.2009)，而在木本植物中，miR172的调控作用还不完全清楚。

miR172除了调控植物的成花时间，对植物的花器官形成也有一定的影响。拟南芥的花朵有四轮花器官，从外到内依次是萼片(第一轮)、花瓣(第二轮)、雄蕊(第三轮)和雌蕊(第四轮)。花器官的形成由A、B和C三类基因进行调控(Causier et al.2010)。AP2属于A类基因，它特异调控第一轮花器官萼片的生长，并与AP3和PI共同调控第二轮花器官花瓣的生长(Wollmann et al.2010)。AP2是miR172的靶基因，miR172可以通过调节AP2的表达来对花器官的形成进行控制，miR172该部分的作用已有实验进行证实。

miRNA在植物的整个生长发育过程中都有着重要的作用，其中miR172在植物的成花过程中是年龄途径中的重要控制基因，miR172在拟南芥中的作用机理目前已经研究的较为透彻，但关于miR172在木本植物中对成花的研究却不是很多。柑橘作为世界上第一大果树，有着重要的经济价值，但其童期长(从栽植到第一次开花的时间)且大部分品种一年成花一次，严重制约了其育种进程。本申请人所在的华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室在前期研究中发现普通枳的早花突变体早实枳(Ai et al.2012；Li et al.2010；Zhang et al.2011)，它的童期只有一至两年，而且可以一年多次成花。早实枳的发现为研究柑橘一年多次成花的机理提供了良好的材料。

发明内容