[发明专利]基于ITS序列位点的鉴别桃仁与苦杏仁的PCR方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于ITS序列位点的鉴别桃仁与苦杏仁的PCR方法及试剂盒。本发明提供了一种鉴别桃仁或苦杏仁的引物，为能扩增出序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸的扩增产物的引物对。本发明的实验证明，通过引物筛选与条件优化，确定引物G4‑7可将桃仁与苦杏仁鉴别开，且其灵敏度高，稳定性好，可用于桃仁与苦杏仁的分子鉴别。相比于传统鉴别，其可信度较高，可用于桃仁药材分子鉴定的推广与应用，且为桃仁药材的快速现场鉴别提供了依据。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于ITS序列位点的鉴别桃仁与苦杏仁的PCR方法及试剂盒。

背景技术

桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica(L.)Batsch或山桃P.davidiana(Carr.)Franch.的干燥成熟种子，具有活血祛瘀、润肠通便、止咳平喘的功效。用于经闭痛经、症瘕痞块、肺痈肠痈、跌扑损伤、肠燥便秘、咳嗽气喘等症的治疗。苦杏仁为蔷薇科同属植物山杏P.armeniaca L.var.ansu Maxim.、西伯利亚杏P.sibirica L.、东北杏P.mandshurica(Maxim)Koehne、或杏P.armeniaca L.的干燥成熟种子。桃仁与苦杏仁在外观上非常相似，经脱皮、炮制加工后更难区分，但二者功效不同，桃仁主用于活血化瘀，而苦杏仁为止咳平喘药。由于桃仁货源较少，价钱较贵，市场上常掺以苦杏仁混充出售。苦杏仁中苦杏仁苷含量较高，苦杏仁苷会释放出含氰的有毒物质，具有较大毒性，混用容易引起潜在的用药风险。因此，建立一种快速、简易、准确鉴定桃仁和苦杏仁及其近缘种的分子鉴定体系，对于控制桃仁的药材质量以及用药安全都具有十分重要的意义。

由于科技的飞速发展，分子鉴定技术逐渐应用于中药鉴定中来。林韵涵等利用DNA条形码技术，通过序列拼接，数据处理，NJ树构建等方法对药材桃仁及其近缘种进行ITS2分子鉴定，结果显示桃种内变异位点为6个，山桃为3个，种内平均K2P距离均为0.009，种间平均K2P距离为0.021，说明桃仁药材的ITS2序列变异小，较为保守和稳定。桃仁药材的两个基原物种的种内平均K2P距离(0.009)小于其与近缘种的种间平均遗传距离(0.037)。表明ITS2序列作为DNA条形码可以有效地鉴定药材桃仁及其近缘种。而特异性PCR技术是一种错配扩增突变分析技术，是根据正品、伪品药材特定区域的DNA序列，设计有高度特异性的正品鉴别引物，此引物能有效扩增来自正品药材DNA模板中的特定区域。鉴定样品时，用鉴别引物对所提取样品的DNA进行PCR扩增经凝胶电泳检测鉴别样品真伪。特异性PCR技术具有以下优势：操作简单、成本低、重复性好；使用特异性引物可极大地降低PCR假阳性率，保证鉴定的准确性；对DNA质量要求不高，所需的DNA量少；PCR鉴定条带单一，真伪药材判定标准简单可靠，无需进行测序及软件分析。特别是近年来快速PCR技术迅速发展，使得中药材分子鉴定在现场快速鉴定上的应用成为了可能。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴别桃仁或苦杏仁的引物。

本发明提供的引物，能扩增出DNA片段A的引物对；

所述DNA片段A是以桃仁为模板，用序列1和序列2所示引物对进行扩增得到的产物。

实际应用中，可能因为模板的不同，扩出的产物存在个别碱基或几个碱基的差异，但这都属于DNA片段A的范畴。

上述引物中，所述引物对由引物1和引物2组成；

所述引物1为如下1)或2)：

1)为序列1所示的单链DNA分子；

2)为序列1删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子；

所述引物2为如下3)或4)：

3)为序列2所示的单链DNA分子；

4)为序列2删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子。