[发明专利]高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法

权利要求书

1.高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以 下步骤进行：

一、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建：

以产酸克雷伯氏菌HD79基因组DNA为模板，分别用ldh-L₁、ldh-L₂和ldh-R₁、ldh-R₂引物 进行PCR反应；

二、pldh-L和pldh-R质粒构建：

向含有ldh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μL5U/μL的 TaqDNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ldh-L和ldh-R，将 片段ldh-L和ldh-R分别与pMD18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为pldh-L和pldh-R；

三、pldh-LR质粒构建：

以pldh-L为骨架，选用限制性内切酶XhoI和EcoRI对质粒载体pldh-L与pldh-R分别 进行双酶切，用T4DNA连接酶将pldh-R的酶切产物连接到pldh-L质粒载体上，得到重组质粒 pldh-LR；

四、pT-Cm^r质粒构建：

以pGP704-Cm为模板，利用Cm-up和Cm-down为扩增引物，对Cm^r进行PCR扩增，对PCR产物 进行TA克隆，得到pT-Cm^r质粒；

五、同源重组片段ldhL-Cm^r-ldhR的构建：

以重组质粒pldh-LR为骨架，选用限制性内切酶XhoI对重组质粒pT-Cm^r和pldh-LR进行 酶切，将获得的Cm^r片段插入质粒载体pldh-LR中，构建质粒载体pT-LCR；

选择限制性内切酶BamHI与BglII对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片段 ldhL-Cm^r-ldhR；

六、K.oxytocaHD79/pKD46菌株构建：

将质粒pKD46电转化到K.oxytocaHD79感受态细胞，得到K.oxytocaHD79/pKD46菌株；

七、同源重组片段ldhL-Cm^r-ldhR转化K.oxytocaHD79/pKD46：

将同源重组片段ldhL-Cm^r-ldhR电转化到K.oxytocaHD79/pKD46中，得到的目的菌株为 高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytocaHD79-01。

2.根据权利要求1所述的高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法， 其特征在于步骤一中ldh-L₁引物序列为5’-GGAAGATCTCAGTACGACAAGAAGTATCTG-3’，ldh-L₂引物序列为5’-CCGCTCGAGACCGAAGCCTTTAAGAATGCGCAGC-3’，ldh-R₁引物序列为5’- CCGCTCGAGCTTCGGTATGCGCCTGCT-3’，ldh-R₂引物序列为5’- GGAGGATCCTCAGACCAGCGCGTTAGGG-3’。

3.根据权利要求1所述的高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法， 其特征在于步骤一中PCR反应体系如下：

PCR扩增的反应程序为：

4.根据权利要求1所述的高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法， 其特征在于步骤四中Cm-up引物序列为5’-CCGCTCGAGGCTTGCGCAGACCAAAACG-3’和Cm-down 引物序列为5’-CCGCTCGAGGCAGGCATGCAAGCTTGGT-3’。