[发明专利]一种针对赭曲霉毒素A的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗原检测技术领域，进一步涉及基于ELISA的抗原检测技术，具体涉及一种针对赭曲霉毒素A的检测方法。

背景技术

赭曲霉毒素是由赭曲霉(Aspergillusochraceors)、疣孢青霉(Pmiciliumvermculosutm)、纯绿青霉(Peniciliumviridicatum)和其他几种青霉属真菌产生的次级代谢产物。赭曲霉毒素为异香豆素类系列衍生物，包括A、B、C等7种结构类似的化合物。其中赭曲霉毒素A毒性最大，可损害动物的肝脏和肾脏，且具有致畸、致癌和致突变作用，被认为与人类巴尔干肾病发生有关。国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)将赭曲霉毒素A定位为2B类致癌物。赭曲霉毒素A常污染小麦、玉米、谷类、咖啡以及葡萄等农作物。因此，建立灵敏、快速的检测方法是有效防治赭曲霉毒素A的重要技术前提。

现有技术中，检测赭曲霉毒素A常用方法包括确证法以及快速筛查法两大类。常用确证法有高效液相色谱法及液相色谱-质谱联用法等。尽管该类方法具有灵敏度高等特点，但需依赖于昂贵的仪器设备和熟练的操作人员，且需复杂的样品前处理，因此无法满足基层及现场实地监控的需要。基于免疫学的快速筛查方法因具有通量高、检测快速、价格便宜等优势，近年来得到了大量的推广和应用。特别是，酶联免疫吸附法(ELISA)方法因具有快速、灵敏、特异、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测等优点，已成为赭曲霉毒素A快速筛查检测的主要方法。然而，现有技术中针对赭曲霉毒素A的ELISA检测方法普遍基于辣根过氧化物酶标记的抗体或抗原催化双氧水生成羟自由基，进而氧化无色的化学显色底物四甲基联苯二胺(TMB)形成蓝色产物，然后使用终止液(2M H₂SO₄)终止反应形成黄色溶液于450nm处记录吸光度值。该类方法因其显色强度较低，因此检测灵敏度相对较低，当待测样品中目标物含量较低时易出现假阴性结果，从而无法满足实际应用的要求。

近年来，一些新型的信号传导机制被报道用于替代传统ELISA的信号传导机制用于提高ELISA的灵敏度，如放射免疫分析底物、化学发光底物、荧光底物以及共振胶体金溶液等。然而，发光体系的构建需要充分考虑被检测对象的分子生物学性质，例如在方法层面，抗体的包被及其与抗原的结合性能，选用何种标记物酶及其与抗体的偶联方法，显色底物的选择以及具体发光方法；在效果层面，既要保证显色反应的灵敏性，又应满足显色强度与目标物含量的线性关系。因此，针对赭曲霉毒素A的ELISA检测方法，尤其以提升其检测灵敏性为目的的方法改进，具有突出的技术难度。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对赭曲霉毒素A的检测方法，以解决现有技术的赭曲霉毒素A ELISA检测方法精度较低。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术用于赭曲霉毒素A检测的ELISA方法中，标记抗原的酶灵敏性较低。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术用于赭曲霉毒素A检测的ELISA方法中，显色系统灵敏性较低。

本发明要解决的又一技术问题是当采用ELISA法检测赭曲霉毒素A时，过程中抗赭曲霉毒素A单抗的包被效果较差。

本发明要解决的又一技术问题是当采用触酶C100作为抗原标记酶对赭曲霉毒素A执行ELISA检测时，具体工艺方法并不明确。

本发明要解决的又一技术问题是当采用触酶C100作为抗原标记酶、采用双氧水和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点作为底物对赭曲霉毒素A执行ELISA检测时，检测结果与抗原浓度的线性关系不佳。

本发明要解决的又一技术问题是当采用触酶C100作为抗原标记酶、采用双氧水和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点作为底物对赭曲霉毒素A执行ELISA检测时，过程中洗涤效果不佳。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种针对赭曲霉毒素A的检测方法，该方法属于直接竞争酶联免疫法，该方法是针对赭曲霉毒素A抗原的检测，该方法中用于标记抗原的酶是触酶C100。

作为优选，该方法中底物包括双氧水和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点。

作为优选，该方法包括以下步骤：

1)包被抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，而后加入待测样品；

2)而后加入触酶C100标记的赭曲霉毒素A，混合后于35～39℃避光环境中反应40～80min，洗涤；