[发明专利]一种针对蜡样芽孢杆菌的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，进一步涉及基于ELISA的抗原检测技术，具体涉及一种针对蜡样芽孢杆菌的快速检测方法。

背景技术

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，属芽孢杆菌属，革兰氏阳性，无荚膜，兼性好氧，生长温度范围20～45℃。广泛存在于土壤、水、空气以及动物肠道中。蜡样芽胞杆菌可引起食物中毒，症状包括恶心、呕吐、腹痛等，直接致病物质是其代谢产物肠毒素，蜡样芽胞杆菌产生的肠毒素有两种：其中一种为耐热型肠毒素，在100℃环境下30min仍具有致病力，再加之蜡样芽胞杆菌自身芽孢具有突出的环境耐受性，因此该菌种严重威胁人类健康。在这种情况下，建立灵敏、快速的检测方法是有效防治蜡样芽孢杆菌的重要技术前提。

现有技术中针对蜡样芽孢杆菌检测方法主要是生化鉴定方法(如GB/T4789.14-2014)，但检测时间长、试剂成本高，而且分离培养的检测方法具有一定的偶然性，因此需要加大实验样本以保证检测结果正确。近年来，随着分子生物学的发展，DNA测序技术在蜡样芽孢杆菌的检测中得到了广泛的应用，此类方法敏感性较高、特异性较强，但缺陷也较为突出一方面其成本较高，此外操作步骤相对繁琐、耗时较长，因此此类方法的产业化应用始终受到限制。近年来，酶联免疫吸附法(ELISA)在蜡样芽孢杆菌的检测中受到了越来越多的重视，此类方法因具有快速、灵敏、特异、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，因此特别适用于大批量样品的检测。然而，现有技术中检测蜡样芽孢杆菌的ELISA方法普遍基于辣根过氧化物酶标记的抗体或抗原催化双氧水生成羟自由基，进而氧化无色的化学显色底物四甲基联苯二胺(TMB)形成蓝色产物，然后使用终止液(2M H₂SO₄)终止反应形成黄色溶液于450nm处记录吸光度值。该类方法因其显色强度较低，因此检测灵敏度相对较低，当待测样品中目标物含量较低时易出现假阴性结果，从而无法满足实际应用的要求。

近年来，一些新型的信号传导机制被报道用于替代传统ELISA的信号传导机制用于提高ELISA的灵敏度，如放射免疫分析底物、化学发光底物、荧光底物以及共振胶体金溶液等。然而，发光体系的构建需要充分考虑被检测对象的分子生物学性质，例如在方法层面，抗体的包被及其与抗原的结合性能，选用何种标记物酶及其与抗体的偶联方法，显色底物的选择以及具体发光方法；在效果层面，既要保证显色反应的灵敏性，又应满足显色强度与目标物含量的线性关系。因此，针对蜡样芽孢杆菌的ELISA检测方法，尤其以提升其检测灵敏性为目的的方法改进，具有突出的技术难度。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对蜡样芽孢杆菌的快速检测方法，以解决现有技术的蜡样芽孢杆菌ELISA检测方法精度较低。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术用于蜡样芽孢杆菌抗原检测的ELISA方法中，标记抗体的酶灵敏性较低。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术用于蜡样芽孢杆菌抗原检测的ELISA方法中，显色系统灵敏性较低。

本发明要解决的又一技术问题是当采用触酶C100作为抗体标记酶对蜡样芽孢杆菌抗原执行ELISA检测时，具体工艺方法并不明确。

本发明要解决的又一技术问题是当采用触酶C100作为抗体标记酶、采用双氧水和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点作为底物对蜡样芽孢杆菌抗原执行ELISA检测时，检测结果与抗原浓度的线性关系不佳。

本发明要解决的又一技术问题是当采用触酶C100作为抗体标记酶、采用双氧水和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点作为底物对蜡样芽孢杆菌抗原执行ELISA检测时，过程中洗涤效果不佳。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种针对蜡样芽孢杆菌的快速检测方法，该方法属于双抗夹心酶联免疫法，该方法是针对蜡样芽孢杆菌抗原的检测，该方法中用于标记抗体的酶是触酶C100。

作为优选，该方法中底物包括双氧水和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点。其中双氧水作为碲化镉量子点荧光淬灭剂，反应过程中，双氧水在触酶作用下分解，从而降低荧光淬灭作用，实现发光。

作为优选，该方法包括以下步骤：

1)包被蜡样芽孢杆菌抗体；

2)取步骤1)包被后的抗体，与待测样品混合后于35～39℃避光环境中反应40～80min，洗涤；

3)而后加入生物素化的蜡样芽孢杆菌单克隆抗体混合，于35～39℃避光环境中反应40～80min，洗涤；