[发明专利]一种针对单增李斯特菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，进一步涉及基于ELISA的抗原检测技术，具体涉及一种针对单增李斯特菌的检测方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是最常见的食源性致病菌之一，属于需氧或兼性厌氧革兰氏阳性菌，呈短小杆菌，两端钝圆，单个呈V型排列，大小约为(0.4-0.5μm)×(0.5-2.0μm)；LM是一种是李斯特菌属中致病性最强的菌，是一种人畜共患的致病菌，也是一种常见的食源性致病菌。能够寄生在动物和人的细胞内并且增值，主要通过李斯特菌溶解素(LLO)、ActA蛋白和内化素实现感染。LM的主要感染对象为新生儿、老年人、孕妇和免疫力缺陷等人群；一般中毒轻者主要表现为肠炎症状，重症者主要表现为脑膜炎、败血症、脑炎、流产、心内膜炎、脓肿和局部的脓性损伤,造成孕妇流产、死胎等病状,发病者死亡率可达高达70％。除此之外，LM能在低温下缓慢繁殖，是冷藏食品的主要感染源，威胁人类健康的主要致病菌。因此，建立灵敏、快速的检测方法是有效防治LM的重要技术前提。

现有技术中，检测LM常用方法包括传统分离培养法、分子生物学方法以及免疫学方法四大类。常用传统分离培养法有脑心浸液培养基(BHA)、含0.6％酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)、李氏增菌肉汤(LB1、LB2)等。该类方法虽操作简单，但耗时长，且容易出现漏检情况；分子生物学方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、随机片段长度多态性(AFLP)、多位点可变数衔接重复序列分析(MLVA)、基因芯片(Gene Chip)、聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)等，尽管该类方法具有灵敏度高等特点，但需依赖于昂贵的仪器设备和熟练的操作人员，且需复杂的样品前处理，因此无法满足基层及现场实地监控的需要。免疫学方法主要包括直接免疫荧光(IFA)法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫磁性分离(IMS)、乳胶凝集试验等，该类方法基于免疫学的快速筛查，具有通量高、检测快速、价格便宜等优势，近年来得到了大量的推广和应用。特别是，酶联免疫吸附法(ELISA)方法因具有快速、灵敏、特异、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测等优点，已成为LM快速筛查检测的主要方法。然而，现有技术中检测LM的ELISA方法普遍基于辣根过氧化物酶标记的抗体或抗原催化双氧水生成羟自由基，进而氧化无色的化学显色底物四甲基联苯二胺(TMB)形成蓝色产物，然后使用终止液(2M H₂SO₄)终止反应形成黄色溶液于450nm处记录吸光度值。该类方法因其显色强度较低，因此检测灵敏度相对较低，当待测样品中目标物含量较低时易出现假阴性结果，从而无法满足实际应用的要求。

近年来，一些新型的信号传导机制被报道用于替代传统ELISA的信号传导机制用于提高ELISA的灵敏度，如放射免疫分析底物、化学发光底物、荧光底物以及共振胶体金溶液等。然而，发光体系的构建需要充分考虑被检测对象的分子生物学性质，例如在方法层面，抗体的包被及其与抗原的结合性能，选用何种标记物酶及其与抗体的偶联方法，显色底物的选择以及具体发光方法；在效果层面，既要保证显色反应的灵敏性，又应满足显色强度与目标物含量的线性关系。因此，针对LM的ELISA检测方法，尤其以提升其检测灵敏性为目的的方法改进，具有突出的技术难度。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对单增李斯特菌的检测方法，以解决现有技术的单增李斯特菌ELISA检测方法精度较低。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术用于单增李斯特菌抗原检测的ELISA方法中，标记抗体的酶灵敏性较低。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术用于单增李斯特菌抗原检测的ELISA方法中，显色系统灵敏性较低。

本发明要解决的又一技术问题是当采用触酶C100作为抗体标记酶对单增李斯特菌抗原执行ELISA检测时，具体工艺方法并不明确。

本发明要解决的又一技术问题是当采用触酶C100作为抗体标记酶、采用双氧水和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点作为底物对单增李斯特菌抗原执行ELISA检测时，检测结果与抗原浓度的线性关系不佳。

本发明要解决的又一技术问题是当采用触酶C100作为抗体标记酶、采用双氧水和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点作为底物对单增李斯特菌抗原执行ELISA检测时，过程中洗涤效果不佳。