[发明专利]一种革兰氏阴性菌胞壁抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种革兰氏阴性菌胞壁抗原的制备方法，特别是涉及一种奇异变形杆菌的胞壁组分多糖与蛋白混合抗原的制备方法。属于生物技术领域。

背景技术

变形杆菌广泛存在于水、土壤腐败的有机物以及人和动物的肠道中，为条件致病菌，可引起慢性中耳炎、创伤感染、膀胱炎、婴儿腹泻、食物中毒，有的菌株可引起败血症、食物中毒、腹膜炎、脑膜炎等。

抗原是一类能刺激机体的免疫系统，使之发生免疫应答，产生抗体与致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合反应的物质。抗原具有两种性能：刺激机体产生免疫应答的免疫原性；与相应免疫应答的产物（抗体或致敏淋巴细胞等）发生特异性结合的免疫反应性。抗原的种类很多，可分为以下几大类：根据抗原物质所起的作用，分为完全抗原和半抗原。如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素等都是完全抗原。半抗原是只具有免疫反应性，而无免疫原性的物质，故又称不完全抗原。半抗原又可分为复合半抗原和简单半抗原。复合半抗原不具有免疫原性，只具免疫反应性，如绝大多数多糖和所有的类脂等；简单半抗原既不具免疫原性，又不具免疫反应性，但能阻止抗体与相应抗原或复合半抗原结合。如肺炎球菌荚膜多糖的水解产物等。另外根据产生抗体时是否需要T细胞辅助，还可分为胸腺依赖性抗原和非胸腺依赖性抗原。

目前常用的革兰氏阴性杆菌胞壁抗原的提取有三种方法。

1热酚法：将菌液反复冻融后，加入热酚溶液，再加热水浴，这种处理过程主要是保留脂多糖成分，而蛋白等抗原成分会被破坏，且苯酚具有强烈的致癌和腐蚀作用，且使用后需要无害化处理，处理成本高，若处理不当会污染环境。

2超声破碎法：此种方法难以把握操作条件，操作中将整个菌体破碎，细菌细胞内容物全部会被释放出来，给后续纯化工作提高难度，且超声造成的瞬间高温可能会将抗原有效表位破坏，导致免疫原性降低，另外超声方法难以适用于大规模生产作业。

3煮沸法：此种方法是将菌体长时间煮沸，处理过程中也存在有效成分被破坏变性的问题，免疫原性无法保证。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在的上述问题，给出一种新型的革兰氏阴性菌胞壁抗原的制备方法。本发明采用盐酸羟胺特异切割Asn-Gly氨基酸位点的方法来获得抗原，再利用无水乙醇作为提取抗原的化学试剂，其毒性和危险性较苯酚小。且本方法避免了苯酚提取多糖抗原时对蛋白质成分的破坏，更大程度的保留了蛋白质抗原成分，以使混合的抗原更加有效的激活免疫应答。

本发明给出的技术方案是：一种革兰氏阴性菌胞壁抗原的制备方法，其特征在于有以下步骤：

（1）菌种的复壮、传代及扩增；

（2）发酵培养基的组成；

（3）细菌发酵罐培养；

（4）抗原的分离和纯化。

所述步骤（1）菌种的复壮、传代及扩增。

将冻干奇异变形杆菌菌种用复苏：将冻干菌株，用酒精擦拭西林瓶铝盖，去除铝盖后，用酒精棉擦拭胶塞及西林瓶表面。

用移液器吸取0.5~1mlNB培养基加入菌株西林瓶中，摇晃混匀成菌悬液，将菌悬液加入含有NB培养基的试管内，轻微振荡后放置于培养箱中，37℃静止培养18~24hr。

菌株传代：用灼烧后的的接种环蘸取NB培养基中的细菌培养物，以划蛇形线的方式接种于无菌NA斜面上，放于恒温培养箱内，37℃培养18~24小时。

菌株扩增：用灼烧后的接种环挑取上步骤中的培养物，用无菌0.9%NaCl冲洗培养物，吹打成均匀菌悬液后，用移液器将菌悬液平铺于NA琼脂方瓶，用分光光度计法检测获得的种子液菌量接近600×10¹⁰个，经革兰氏染色镜检合格后用于发酵罐培养。

所述步骤（2）发酵培养基的组成。

酪蛋白水解物20~30g/L、酵母浸粉8~17g/L、CH₃COONa4~12g/L、MgSO₄0.15~0.35g/L、Na₂HPO₄0.1~0.5g/L、NaH₂PO₄0.1~0.4g/L、C₆H₁₂O₆2~6g/L，上述培养基成分按比例添加配制成发酵液，之后经高压蒸汽灭菌的0.1+0.2μm孔径套筒滤器过滤除菌备用。

所述步骤（3）细菌发酵罐培养。