[发明专利]莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体，其特征在于，包括骨架载体pJD124和CrDof基因目的片段，所述CrDof基因受诱导启动子Hsp70A-RBCS2的调控，热激后CrDof可大量表达，获得的重组表达载体pJD-CrDof的核苷酸序列为SeqIDNO.1。

2.一种莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)CrDof基因目的片段的获得

提取莱茵衣藻总RNA，将其反转录为cDNA，以cDNA为模板，根据已知的莱茵衣藻Dof基因设计引物对莱茵衣藻CrDof基因目的片段进行PCR扩增，扩增出1875bp的CrDof基因目的片段；

2)重组表达载体pJD-CrDof的构建

将CrDof基因目的片段和骨架载体pJD分别用PmacI和KpnI双酶切，将CrDof基因目的片段连接到骨架载体pJD对应的酶切位点上，获得重组表达载体pJD-CrDof。

3.根据权利要求2所述的莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于，扩增CrDof的引物序列为：

CF：5’cacgtgCATGGTAGACGGTGGTTCG(PmacI)3’；

CR：5’ggtaccTTCACCTAGCACCCGAGTAA(KpnI)3’。

4.一种莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体的应用，其特征在于，将重组表达载体pJD-CrDof转化入莱茵衣藻基因组中构建转基因工程藻，以调控莱茵衣藻油脂代谢并提高油脂含量的应用。

5.根据权利要求4所述的莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体的应用，其特征在于，构建所述转基因工程藻包括以下步骤：

1)构建CrDof基因的重组表达载体pJDluc-crdof；

2)采用珠磨法将pJDluc-crdof转入莱茵衣藻的受体藻株中；

3)培养和筛选表达CrDof基因的转基因莱茵衣藻。

6.根据权利要求5所述的莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体的应用，其特征在于，在构建转基因工程藻的过程中，使用到的转基因受体藻株为细胞壁缺陷型莱茵衣藻，采用珠磨法进行遗传转化，在转基因受体藻株筛选标记的选择中，选择抗生素筛选标记。

7.根据权利要求6所述的莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体的应用，其特征在于，所述细胞壁缺陷型莱茵衣藻的培养基为TAP培养基，莱茵衣藻单藻落从固体TAP平板中接种到新鲜无菌的液体TAP培养基中培养至对数中期，再进行目的基因的转入。

8.根据权利要求6所述的莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体的应用，其特征在于，培养获得所述转基因藻株后，采用热激诱导的方法表达目的基因，大幅提高CrDof基因表达量，增加工程藻油脂含量；热激诱导的温度为40-45℃，优选40℃。热激诱导时转基因藻密度在5×10⁵-5×10⁶cells/ml之间，优选2×10⁶cells/ml。热激诱导后转基因藻株油脂含量增加。热激诱导方式为一次或者多次。一次热激的处理时间在30-60min，优选30min；多次热激的处理为每次30min，热激后需要正常培养3-5h，优选4h，再进行下次热激。

9.根据权利要求6所述的莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体的应用，其特征在于，对所述转基因莱茵衣藻进行热激处理后，利用荧光定量PCR技术对转基因藻株中CrDof基因以及与油脂代谢酶基因的表达量进行分析。

10.根据权利要求8所述的莱茵衣藻Dof基因的重组表达载体的应用，其特征在于，对所述转基因莱茵衣藻进行热激处理后，还要筛选出转化株进行GC-MS测定，以对转基因藻株的脂肪酸含量和成分进行分析。