[发明专利]一种利用两轮共培养和絮凝法制备菌藻细胞的方法

说明书

本发明公开了一种利用两轮共培养和絮凝法制备菌藻细胞的方法，包括：1)将第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻在光照下进行第一轮菌藻共培养，培养结束后，得到第一轮菌藻共培养液；2)在第一轮菌藻共培养液中再补加第二次加入的水稻内生泛菌，在光照下进行第二轮菌藻共培养，培养结束后，得到第二轮菌藻共培养液；3)对第二轮菌藻共培养液进行絮凝采收处理，得到菌藻细胞。本发明通过应用水稻内生泛菌和小球藻进行菌藻共培养提高藻细胞的生长速率和生物量，同时改善藻细胞絮凝性能，减少化学絮凝剂的使用和对藻细胞的毒害，提高藻细胞采收效率，降低藻细胞采收成本，从而大幅降低蛋白核小球的工业生产和开发应用成本。

技术领域

本发明涉及菌藻共培养技术领域，具体涉及一种利用两轮共培养和絮凝法制备菌藻细胞的方法。

背景技术

小球藻是一种单细胞绿藻，其环境适应性强，易于大规模培养，细胞中含有丰富的营养物质，广泛应用于保健食品、饲料、食品添加剂、精细化加工品和作为医药制剂原料。小球藻富含短链脂肪酸，是优质的生物柴油原料(徐进,徐旭东,方仙桃,胡晗华.高产油小球藻的筛选及其油脂分析.水生生物学报,2012,36(3):426-432.)。蛋白核小球藻是我国常见的小球藻品种，其含量蛋白高，必需氨基酸丰富，是一种优良的饲料蛋白源(李国平.蛋白核小球藻粉中氨基酸含量和饲用价值分析.中国野生植物资源.2003，22(2):23-25)。近年来小球藻的生产效益显著，前景十分广阔。特别是新兴的菌藻共生技术有望突破当前小球藻开发方面存在的产率低、收获难、成本高等技术限制，倍受业界关注。

已有研究表明微藻和微生物之间存在从寄生到共生等广泛的互作现象，某些微生物能通过分泌生长激素和信号调节物质促进藻细胞生长，提高藻细胞生物量和生化组分的积累[Ueda H,Otsuka S,Senoo K.Bacterial communities constructed in artificialconsortia of bacteria and Chlorella vulgaris.Microbes Environment,2010,25(1):36-40.]。但不同种类的细菌对小球藻生长和代谢的影响不同，有的促进，有的抑制，效果差别很大。通过筛选获得优良菌株作为小球藻的共生菌，人工构建菌藻共生体系一方面有望使藻细胞生长速率大幅提高(Park Y,et al.Growth promotion of Chlorellaellipsoidea by co-inoculation with Brevundimonas sp.isolated from themicroalga.Hydrobiologia,2008,598(1):219-228；Kim B H,et al.Role of rhizobium,aplant growth promoting bacterium,in enhancing algal biomass throughmutualistic interaction.Biomass and Bioenergy,2014,69(3):95-105.)，克服小球藻生物产量低的技术难题。另一方面，由于小球藻细胞体积小(3-12μm)，密度低，其细胞表面带负电荷，在分散状态下十分稳定，难以沉降，这些特点使小球藻采收困难，增加了能耗和生产成本。目前小球藻采收方法有絮凝法、离心法、过滤法和气浮法等，其中离心分离是国内外工厂微藻采收普遍使用的方法，但此法设备投资大，收获成本高，当前小球藻细胞收获成本大约占生产总成本的1/3，限制了小球藻的工业化应用，寻求低成本、高效率的微藻细胞采收途径是微藻产业化亟需解决的问题之一(Lee J,Cho D H,Ramanan R,Kim B H,Oh HM,Kim H S.Microalgae-associated bacteria play a key role in the flocculationof Chlorella vulgaris.Bioresource Technology,2013,131(2):195-201.张海阳等：能源微藻采收技术研究进展。2013,32(9)：2092-2098.)。絮凝沉降法主要是利用化学絮凝剂的带电性质使藻细胞聚集沉降，具有成本低廉，操作简单，实用性强的优势。但单纯化学絮凝对小球藻沉降作用可能不理想，而且过高的化学絮凝剂浓度对小球藻产生毒害作用，影响小球藻后续的工业化应用[左志鹏，等.絮凝沉降法采收小球藻的研究.湖北农业科学,2015,54(9):2206-2213.]。生物絮凝剂是微生物自身产生的、具有高效的絮凝作用的天然高分子物质，主要包括糖、糖脂、蛋白质、DNA等几类物质，生物絮凝剂的作用是多因素作用的共同结果，主要是通过桥联作用、电性中和、卷扫作用和一些复杂的化学反应对微藻进行絮凝沉降。与传统的絮凝剂相比，生物絮凝剂易被微生物降解，对环境无毒无害、絮凝效果明显、适用范围广、絮凝剂的产生菌来源多(施春阳,等.微生物絮凝剂的研究和应用进展[J].污染防治技术,2013,26(3):48-51.)。Andrew等报道将球石藻(Pleurochrysiscarterae)与一种微生物共生培养，后者在培养体系的营养组份消耗殆尽时将产生一种具有絮凝作用的胞外物质，从而使球石藻絮凝，回收率可达90％(Andrew K L，etal.Microbial flocculation，a potentially low-cost harvesting technique formarine microalgae for the production of biodiesel[J].Journal of AppliedPhycology，2009，21(5)：559-567.)。微生物共生法与传统离心或过滤方法相结合，能实现能源微藻低成本、高效率、无污染的采收(张海阳等：能源微藻采收技术研究进展。2013,32(9)：2092-2098.)。因此，人工构建菌藻共生体系中的优良共生菌有可能通过产生生物絮凝剂类物质改善小球藻细胞的絮凝性能，与化学絮凝剂配合使用应用于藻细胞采收时，减少化学絮凝剂的使用剂量，在一定程度上减轻化学絮凝剂的毒害作用，并大幅降低藻细胞的收获成本。