[发明专利]鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记引物组及其应用

权利要求书

1.一种鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记引物组，该引物组由5对引物组成， 分别为：

分子标记NAU3995的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷 酸序列如SEQIDNO.2所示；

分子标记MUCS101的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物核苷 酸序列如SEQIDNO.4所示；

分子标记DPL0917的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物核苷 酸序列如SEQIDNO.6所示；

分子标记DPL0528的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，下游引物核苷 酸序列如SEQIDNO.8所示；

分子标记NAU4926的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，下游引物核苷 酸序列如SEQIDNO.10所示。

2.权利要求1所述SSR分子标记引物组在鉴定鲁棉研34号品种纯度中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)将待检测棉花干种子室温条件下浸泡后，去除种皮，浸入裂解缓冲液中，破碎后， 在60～70℃水浴15～25min，离心，取上清，然后加入预冷的异丙醇，离心，取沉淀，经洗 涤、晾干，加双蒸水溶解后，离心，取上清，制得DNA提取样品；

(2)以步骤(1)制得的DNA提取样品为模板，分别以SSR分子标记引物组中的5对 引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

(3)分别对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行电泳检测，经染色后，将染色结果的带 型与鲁棉研34号父、母本的染色结果的带型进行对比，同时具有父母双亲本特异条带的种 子或单株鉴定为真正的杂交种，缺少其中的任意一个条带均被视为假杂种，种子纯度按如下 方法计算：

种子纯度＝检测到的与鲁棉研34号纯品的带型相同的个数/检测总数×100％。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的浸泡时间为18～24小时；离心条件为：4℃、 12000r/min离心8min；所述洗涤为采用体积百分比为70％的乙醇溶液洗涤；所述预冷的异 丙醇加入量为0.7倍体积。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的裂解缓冲液中含有如下 成分：

2wt％十六烷基三甲基溴化铵，0.02mol/L四乙酸二氨基乙烷，1.4mol/LNaCl，0.1 mol/LTris-HCl，2wt％聚乙烯吡咯烷酮，1wt％β-巯基乙醇。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下，总 体系体积10μL：

10×PCRBuffer1μL，10mMdNTPMix0.2μL，10μmol/L的正向引物0.6μL、10μmol/L 的反向引物0.6μL，5UTaqDNA聚合酶0.1μL，20～200ng/μL的待测样品DNA2μL， ddH₂O5.5μL。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR反应程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸50s，循环32次；72℃延 伸5min。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，所述电泳为采用8wt％ 非变性聚丙烯酰胺电泳。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，染色步骤如下：

用0.1wt％的AgNO₃溶液染色10min，再用含2wt％NaOH和0.4wt％甲醛的水溶液显影 至带型清晰。