[发明专利]一种红曲霉菌体ACE抑制肽的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于多肽物质纯化技术领域，具体涉及一种红曲霉菌体ACE抑制肽的纯化方法。

背景技术

随着社会发展和人们生产、生活水平的提高，人口平均年龄增长，饮食结构改变，盐摄入量增高，以致高血压、高血压性心脏损害患病率增加。高血压不仅是一个独立的疾病，也是脑中风、冠心病、肾功能衰竭和眼底病变的重要危险因素，高血压患者还常常伴有糖尿病等慢性疾患,因此，有效地预防并控制高血压对人体健康具有重要意义。

降血压肽，又称为血管紧张素转化酶(AngioensinIConvertingEnzyme，简称ACE)抑制肽，是从食物蛋白中分离出的一类具有显著降低血压功效的短链多肽物质。这些来源于食品的降血压肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高，其共同突出优点是只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用，因而不会有降压过度现象发生。

红曲霉菌丝体ACE抑制肽为使用包括胃蛋白酶在内的复合蛋白酶酶解天然食源性物质红曲霉所得的一类小分子多肽物质。已有研究表明红曲霉固态发酵产物红曲米的浸提物具有较好的ACE抑制活性，并且可以从浸提物中分离出具有ACE抑制活性的小分子多肽。目前，基于ACE抑制活性的降血压药物主要是卡托普利，依那普利等化学合成类药物，对人体有一定的副作用，若能将天然的ACE抑制活性多肽应用于降血压药物或保健品中，前景将十分广泛，市场潜力巨大。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种条件温和，所得红曲霉菌丝体ACE抑制肽活性组分纯度高且活性强的红曲霉菌丝体ACE抑制肽的纯化方法。

为实现本发明的目的，发明人通过大量实验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：

一种红曲霉菌体ACE抑制肽的纯化方法，该方法包括以下步骤：

（1）红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉的复溶：将真空冷冻干燥得到的红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉使用PBS缓冲液进行复溶，PBS缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.3-7.5；

（2）柱层析分离菌丝体ACE抑制肽：对复溶后的红曲霉菌丝体ACE抑制肽溶液进行离心，3000r/min条件下离心5min，收集上清液后使用0.22微米的水系微孔滤膜过滤处理，所得滤液采用葡聚糖凝胶柱层析，收集红曲霉菌丝体ACE抑制肽活性组分峰；

（3）活性组分峰的富集：将步骤（2）收集的各组分收集液冷冻干燥后使用PBS缓冲液配成相同浓度，分别测定各组分的ACE抑制活性，PBS缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.3-7.5；

(4)RP-HPLC分离菌丝体ACE抑制肽：对步骤（3）中具有最高ACE抑制活性的组分E进行离心，3000r/min条件下离心5min，收集上清液后再使用0.22微米的水系微孔滤膜过滤处理，所得滤液采用RP-HPLC进行进一步分离，条件为：进样量10mL，柱温25℃,流动相为超纯水，流速5mL/min,蛋白检测波长为220nm；

(5)RP-HPLC活性组分峰的富集：收集组分E经RP-HPLC分离所得的各活性组分峰，将各组分收集液冷冻干燥后使用PBS缓冲液配成相同浓度，并分别测定各组分的ACE抑制活性，PBS缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.3-7.5。

优选地，如上所述的一种红曲霉菌体ACE抑制肽的纯化方法，其中步骤（2）中所述的葡聚糖凝胶柱层析为GE公司superdex30pg葡聚糖凝胶柱，层析条件为：进样量10mL，柱温25℃,流动相为超纯水，流速1mL/min,蛋白检测波长为280nm。

优选地，如上所述的一种红曲霉菌体ACE抑制肽的纯化方法，其中步骤（3）、（5）中所述的ACE抑制活性测定的方法为：样品溶于超纯水，离心(7200×g，15min)，取上清液10μL和40μL2.17mmol/L底物(hippuryl-L-His-L-Leu溶于pH8.30.05mol/L硼酸缓冲液，其中含0.3mol/LNaCl)于37℃保温6min，加入20μLACE(0.1U溶于1.0mL相同的缓冲溶液中)，37℃下反应30min后，加入80μL1mol/L的HCl溶液终止反应，至室温取10μL反应产物进样。