[发明专利]水稻OsCSA基因的应用及其定点敲除方法

说明书

本发明提供一种水稻OsCSA基因的应用及其定点敲除方法，所述雄性不育基因CSA编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用具体是，采用基于CRISPR/Cas9系统敲除、改变或抑制CSA基因，使得常规水稻品种中的CSA基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。所述定点敲除方法为分别利用基于CH‑CRISPR/Cas9系统的CC‑CSA‑1载体和基于Gateway‑CRISPR/Cas9系统的GC‑CSA‑1载体对水稻雄性不育基因CSA进行定向基因编辑。本发明为创造基于水稻雄性不育基因CSA的雄性不育系种质资源、水稻两系杂交制种提供一种高效的敲除方法和育种方式。

技术领域

本发明属于水稻育种技术领域，涉及水稻OsCSA基因的应用及其定点敲除方法，具体地，涉及一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻雄性不育基因CSA定点敲除方法及利用该方法在不同水稻品种中的创制雄性不育系的应用。

背景技术

雄性不育系为水稻杂交制种技术提供关键的育种材料，在全世界范围内展开了广泛的研究。水稻花粉碳饥饿(Carbon Starved Anther，csa)基因编码一个参与水稻花药发育和糖分配调控的R2R3MYB转录因子，主要在花药绒毡层细胞和糖转运维管组织中表达(Zhang et al,2010)。CSA基因的突变会造成水稻光敏雄性不育，表现出在短光照下雄性不育、长日照下恢复可育的特征；此外，csa不育系和恢复系JP69杂交产生的F1代具有杂种优势(Zhang et al,2013)，因此，基于csa的光敏雄性不育系，可用于水稻两系杂交稻制种，应用前景广阔。

CRISPR/Cas9(成簇、规律间隔短回文重复序列及相关蛋白)系统是近几年出现的基因组编辑新技术，在各种生物和细胞等领域都有广泛的研究和应用。CRISPR/Cas9系统是一种源于原核生物抵御噬菌体、质粒等入侵长期进化的获得性免疫系统，其在指导RNA下完成对外源遗传物质的降解。CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白与sgRNA形成复合体，切割与sgRNA上spacer互补的基因组DNA序列，产生DNA双链断裂(DSB)，激活细胞启动DNA损伤修复机制，通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)方式引入突变。与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas9系统技术具有设计简单、构建快速、突变效率高、多把点同时编辑等优势。

目前，水稻雄性不育系的创制主要是通过杂交将不育基因或位点导入其他水稻品种中，但是转育周期较长、过程较复杂、劳动成本大。通过CRISPR/Cas9系统的靶向修饰直接对水稻CSA基因进行定点突变或敲除，创制基于CSA基因的水稻雄性不育株系，大大缩短育种周期。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种水稻OsCSA基因(即水稻雄性不育基因CAS)的应用及其定点敲除方法，提供了一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻雄性不育基因CSA定点敲除方法及利用该方法在不同水稻品种中的创制雄性不育系的应用，利用CSA基因及其蛋白参与水稻花药发育调控的特点及CRISPR/Cas9系统的基因组靶向修饰，通过突变CSA基因核苷酸序列筛选水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种水稻OsCSA基因的应用，所述OsCSA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用具体是，采用基于CRISPR/Cas9系统敲除、改变或抑制CSA基因，使得常规水稻品种中的CSA基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。

优选地，所述CRISPR/Cas9系统为II类CRISPR/Cas9载体系统。

优选地，所述CRISPR/Cas9载体系统为：基于psgR-Cas9-Os和pCAMBIA1300载体的CH－CRISPR/Cas9构建、基于pOs-sgRNA和pH-Ubi-Cas9载体的Gateway-CRISPR/Cas9构建中的一种或两种；